# BLAST+ 的安裝與基礎使用
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許多需要做物種序列比對的人都用過 NCBI 的 [BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）網頁服務](https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，其實他們也有推出單機版的一系列程式 [BLAST+ executables](https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastDocs&DOC_TYPE=Download)，最新版可以從 https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ 取得。

在 Ubuntu 中的安裝方法：

wget https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ncbi-blast-2.13.0+-x64-linux.tar.gz
tar -zxvf ncbi-blast-2.13.0+-x64-linux.tar.gz 
sp -r ./ncbi-blast-2.13.0+ ~/
export PATH=~/ncbi-blast-2.13.0+/bin:$PATH
#檢查是否安裝成功
blastn -version

最後要編輯 `/etc/profile` 加入 `export PATH=${PATH}:/home/USERNAME/ncbi-blast-2.13.0+/bin`
如果下載的是 `.rpm` 檔，用 `rpm -ivh` 指令安裝即可。
裝好之後，就可以在電腦用指令來做序列比對了。
這是平常在比對序列的時候，自己常用的指令：

$ blastn -remote -db nt -query filename.fasta -outfmt "6 qseqid qgi evalue bitscore pident staxids sscinames" -out outputfilename  -perc_identity 90 -evalue 1e-5 -max_hsps 1

最後的輸出會是一個 tab 分隔的文字檔（tsv）。
裡面幾個常用參數解釋如下：
* `-remote` 遠端模式，直接上 NCBI GeneBank 的資料庫比對，而不使用本機儲存的資料庫。
* `-db` database，這邊選的是 `nt`，也就是 nucleotide 資料庫。
* `-query` 與 `-out` 分別指定輸入與輸出的檔名。
* `-outfmt` 指定輸出的樣式，選擇 6 可以自由指定所需要的參數，參數與其他的樣式詳見後述。
* `perc_identity` 指定比對的結果，只回傳大於指定相似度的結果。
* `evalue` 比對的期望值（越小越好），只回傳小於指定期望值的結果。預設值為 10，一般會設定 1e-5，即 $10^{-5}$。
* `max_hsps` 指定如果一條 query 序列和目標序列有多處對應，可以回傳多少結果。這個指令在 query 序列比較短或目標序列長的情況下可能使用，會依照 evalue 的排序來輸出指定數量的結果。

### 輸出結果的格式與參數
依據 NCBI 的[說明文件](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279684/table/appendices.T.options_common_to_all_blast/)，我們可以選擇不同的輸出格式 outfmt：
| outfmt | 格式 |
|---|---|
| 0 | pairwise |
| 1 | query-anchored showing identities |
| 2 | query-anchored no identities |
| 3 | flat query-anchored, show identities |
| 4 | flat query-anchored, no identities |
| 5 | XML Blast output |
| 6 | tabular |
| 7 | tabular with comment lines |
| 8 | Text ASN.1 |
| 9 | Binary ASN.1 |
| 10 | Comma-separated values |
| 11 | BLAST archive format (ASN.1) |
| 12 | Seqalign (JSON) |
| 13 | Multiple-file BLAST JSON |
| 14 | Multiple-file BLAST XML2 |
| 15 | Single-file BLAST JSON |
| 16 | Single-file BLAST XML2 |
| 17 | Sequence Alignment/Map (SAM) |
| 18 | Organism Report |

如果使用的是 outfmt 6, 7 或 10，以下這些是可已自行選擇加入的參數：
| 參數 | 解釋 |
| -------- | -------- |
| qseqid | Query Seq-id |
| qgi | Query GI |
| qacc | Query accesion |
| qaccver | Query accesion.version |
| qlen | Query sequence length |
| sseqid | Subject Seq-id |
| sallseqid | All subject Seq-id(s), separated by a ';' |
| sgi | Subject GI |
| sallgi | All subject GIs |
| sacc | Subject accession |
| saccver | Subject accession.version |
| sallacc | All subject accessions |
| slen | Subject sequence length |
| qstart | Start of alignment in query |
| qend | End of alignment in query |
| sstart | Start of alignment in subject |
| send | End of alignment in subject |
| qseq | Aligned part of query sequence |
| sseq | Aligned part of subject sequence |
| evalue | Expect value |
| bitscore | Bit score |
| score | Raw score |
| length | Alignment length |
| pident | Percentage of identical matches |
| nident | Number of identical matches |
| mismatch | Number of mismatches |
| positive | Number of positive-scoring matches |
| gapopen | Number of gap openings |
| gaps | Total number of gaps |
| ppos | Percentage of positive-scoring matches |
| frames | Query and subject frames separated by a '/' |
| qframe | Query frame |
| sframe | Subject frame |
| btop | Blast traceback operations (BTOP) |
| staxids | Subject Taxonomy ID(s), separated by a ';' |
| sscinames | Subject Scientific Name(s), separated by a ';' |
| scomnames | Subject Common Name(s), separated by a ';' |
| sblastnames | Subject Blast Name(s), separated by a ';' (in alphabetical order) |
| sskingdoms | Subject Super Kingdom(s), separated by a ';' (in alphabetical order) |
| stitle | Subject Title |
| salltitles | All Subject Title(s), separated by a '<>' |
| sstrand | Subject Strand |
| qcovs | Query Coverage Per Subject |
| qcovhsp | Query Coverage Per HSP |

以上是在本機使用 BLAST+ 工具進行序列的線上比對流程筆記；而取得大量序列資料與自建本機資料庫，另外再來談。
<span style="font-size:30px">🐕‍🦺</span> 2022.11.08