# **Tutorial Extended Bayesian Skyline Plot**

Todas as análises abaixo são feitas com os programas do pacote **BEAST versão 2.3.2** (Dwnload em: https://github.com/CompEvol/beast2/releases/tag/v2.3.2)

**1. BEAUti**

* Abra o BEAUti
* Importe o seu arquivo `.nex` em: `File > Import Alignment`
* Se tudo ocorrer de forma correta o seu arquivo será importado e informações como número de sequências e tamanho das sequências aparecerão na tela.
* Vá para a aba `Site Model`
* Altere o modelo de substituição nucleotídicas para aquele encontrado no MrModeltest.
* Mude as frequências para `Emirical`
* Vá para a aba `Clock Model`
* Coloque a taxa de mutação em `Clock.rate` para o gene escolhido.
**COI de insetos = 3.54% mutações por milhões de anos (Papadopoulou, 2010)**
**Coloque a taxa de 0.354 se quiser o gráfico final com o eixo x de 100.000 em 100.000 anos, 0.0354 de 10.000 em 10.000 anos, ou 0.00000354 se quiser de ano em ano**
* Em `Mode` desmarque a opção `Automatic set clock rate`
* Marque a opção `estimate` em `clock.rate`
* Vá para a aba `Priors`
* Em `tree.t.NOME_DO_SEU_ARQUIVO_NEX` altere para `Coalescent Extended Bayesian Skyline`
* Clique na seta para a direita em `tree.t.NOME_DO_SEU_ARQUIVO_NEX` e em seguida no ícone de lápis e coloque o valor de **0.5** se for um gene mitocondrial. (Esse valor vai dividir por 2 o valor da taxa de mutação por se tratar de um gene haploide).
* Clique na seta para a direita em `clock.Rate.c:NOME_DO_SEU_ARQUIVO_NEX` e substitua o limite superior de infinito (**Infinite**) para **1.0**
* Finalmente em `populationMean.alltrees`, altere o valor de **1/X** para uma distribuição **Normal**, depois clique na setinha para a direita, e altere o valor da **média** (Mean) para **1** e do sigma (desvio padrão) para **0.1**. Como na imagem abaixo:
* No Menu `View` marque a opção `Show Operators panel`
* E altere o valor de **0.1** para **3.0** na opção cale: `kappa.s:NOME_DO_SEU_ARQUIVO_NEX Scale HKY transition-transversion parameter of partition s:NOME_DO_SEU_ARQUIVO_NEX`
* Vá para a aba `MCMC` e em Chain Lenght coloque **100000000** (Cem milhões). Em **tracelog** você pode alterar o nome do arquivo que sairá no final das análises.
* Salve o arquivo em `File > Save as` com o nome escolhido na extensão **.xml**

**2. BEAST**

* Abra o **BEAST**
* Em `BEAST XML File` escolha o seu arquivo `.xml` que salvou do programa BEAUti.
* Clique em **Run** e aguarde as análises terminarem.

**3. Tracer**

* Download do tracer `https://github.com/beast-dev/tracer/releases/tag/v1.7.2`
* Abra o **Tracer** o arquivo `.log` gerado no final da corrida do `BEAST` no Tracer clicando no botão `+`
* Verifique se os valores da coluna **ESS (Effective Sample Size)** ficaram maiores do que **300**. Valores abaixo de 300 não são bons, e para aumentar esses valores deve-se **aumentar o número de cadeias MCMC** no programa **BEAUt**i e **rodar o BEAST novamente**.
* No Tracer também verifique a aba `sum(indicators.alltrees)` e deve-se encontrar uma figura parecida com a figura abaixo. Isso indica que podemos rejeitar com confiança uma população constante, uma vez que o HPD de 95% (Highest Posterior Density) exclui 0.

**4. Plotando os gráficos no R**

* Abra o **RStudio**
* Clique no botão **NewFile** e selecione **R script** (Figura abaixo)
* Em `Session` selecione a opção `Set Working Directory` e em seguida `Choose Directory`
* Escolha a pasta do seu computador onde estão os arquivos que saíram do **BEAST**
* Copie o arquivo chamado **plotEBSP** (Esse arquivo está dentro da pasta zipada **ebsp2-tut > scripts**) que veio junto com o tutorial e também coloque na mesma pasta dos seus arquivos.
* Copie as 5 linhas abaixo e cole na área em branco do R:

source("../scripts/plotEBSP.R")
plotEBSP("EBSP.log", useHPD=FALSE, log="y")
plotEBSP("EBSP.log", useHPD=FALSE, xlim=c(0, 0.03))
plotEBSPTimesHist("EBSP.log")
plotEBSP("EBSP.log", useHPD=FALSE, plotPopFunctions=TRUE, log="y")

* Substitua todos os nomes de **"EBSP.log"** pelo nome do seu arquivo **"".log"**, para fazer isso use a função replace (ícone de lupa)
* Rode o script linha por linha clicando na linha desejada e depois no botão **Run**
* Os gráficos aparecerão na área de **Plots** do **R**
* Para salvar clique em **Export** e salve como **imagem** ou **pdf**