# Qiime2 | 05 Alpha和Beta多樣性分析 | 微生物體16S擴增子定序(16S Amplicon Sequencing)
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> 利用宏基因組、16SrRNA測序等高通量測序技術分析微生物群體結構的時候，常見的有α和β多樣性兩個指標。
## :memo: Where do I start?

### Alpha多樣性分析
> Alpha多樣性主要反映樣本內多樣性。在腸道菌群分析中，是用來衡量個體內菌群的多樣性，注意是單個個體，不涉及個體間的比較。Alpha多樣性主要與兩個因素有關：一是種類數目，即豐富度；二是多樣性，群落中個體分配上的均勻性。通常有三類相關指數，測序深度指數（Observed spieces 和Good's coverage）、菌群豐度指數（Chao1 和ACE）和菌群多樣性指數（shannon 和simpson）。

> Observed spieces：代表實際觀測到的OTUs數量。
> Good's coverage：反應了測序的深度，指數越接近1，說明測序深度已經覆蓋到樣本中的所有物種。

>Chao指數和Ace指數：都是用來估計群落中含有OTU數目的指數。Chao和Ace越大，說明群落中含有的OTU數目越多，群落的豐富度越大。

>Simpson指數：指隨機抽取的兩個個體屬於不同種的概率，用來估算微生物群落的多樣性。Simpson數值越大，說明群落多樣性越高。

>Shannon指數：用來估算樣品中微生物的多樣性指數之一。包括豐富度richness和均勻度evenness兩個層面。Shannon值越大，說明群落多樣性越高。

### QIIME2中重要的Alpha多樣性指數：
* Evenness：群落均勻度的定性度量。
* Observed OTUs可觀測的OTU：群落豐富度的定性度量，只包括豐富度。
* Faith's系統發育多樣性：群落豐富度的定性度量，包含特徵之間的系統發育關係。
* Shannon香農多樣性指數：群落豐富度的定量度量，包括豐富度richness和均勻度evenness兩個層面，較常用。

### Beta多樣性分析
> Beta多樣性指的是樣本間多樣性。在腸道菌群分析中，Beta多樣性是衡量個體間微生物組成相似性的一個指標。個體之間物種的有無和不一致性通常影響β多樣性指數，α多樣性指數也會影響β多樣性指數。我們通過計算樣本間距離可以獲得β多樣性計算矩陣，後續一般會利用PCoA、進化樹聚類等分析對此數值關係進行圖形展示。通過Unifrac計算出樣本間的Beta值，數值為0時表示兩個樣本間不存在多樣性差異，數值越接近1表示樣本間的Beta多樣性差異越大。

>Beta多樣性計算中主要基於OTU的群落比較方法，有歐式距離、bray curtis距離、Jaccard距離，這些方法優勢在於算法簡單，考慮物種豐度（有無）和均度（相對豐度），但其沒有考慮OTUs之間的進化關係，認為OTU之間不存在進化上的聯繫，每個OTU間的關係平等。另一種算法Unifrac距離法，是根據系統發生樹進行比較，並根據16s的序列信息對OTU進行進化樹分類，一般有加權和非加權分析。

### QIIME2中重要的Beta多樣性指數：
* Jaccard距離：群落差異的定性度量，即只考慮種類，不考慮豐度。
* Bray-Curtis距離：群落差異的定量度量，較常用。
* Unweighted UniFrac距離：包含特徵之間的系統發育關係的群落差異定性度量。
* Weighted UniFrac距離：包含特徵之間的系統發育關係的群落差異定量度量。

### 計算核心多樣性

qiime diversity core-metrics-phylogenetic \  
  --i-phylogeny rooted-tree.qza \
  --i-table table.qza \
  --p-sampling-depth 1414 \
  --m-metadata-file metadata.tsv \ 
  --output-dir core-metrics-results

> 需要提供給這個腳本的一個重要參數是–p-sampling-depth，它是指定重採樣（即稀疏rarefaction）深度。因為大多數多樣指數對不同樣本的不同測序深度敏感，所以這個腳本將隨機地將每個樣本的測序量重新採樣至該參數值。例如，提供–p-sampling-depth 500，則此步驟將對每個樣本中的計數進行無放回抽樣，從而使得結果表中的每個樣本的總計數為500。如果任何樣本的總計數小於該值，那麼這些樣本將從多樣性分析中刪除。

> 選擇這個值很棘手。建議通過查看table.qzv文件中呈現的信息，並選擇一個盡可能高的值，即每個樣本保留更多的序列，同時盡可能少地排除樣本。如果數據量都很大，選最小的即可。如果有個別數據量非常小，去除最小值再選最小值。（故本分析選擇1414）

### 輸出對象(13個數據文件):
* arefied_table.qza:等量重採樣後的特徵表。
* observed_otus_vector.qza: Alpha多樣性observed otus指數。
* faith_pd_vector.qza: Alpha多樣性考慮進化的faith指數。
* shannon_vector.qza: Alpha多樣性香農指數。
* evenness_vector.qza: Alpha多樣性均勻度指數。
* bray_curtis_distance_matrix.qza: Bray-Curtis距離矩陣。
* jaccard_distance_matrix.qza: jaccard距離矩陣。
* weighted_unifrac_distance_matrix.qza:有權重的unifrac距離矩陣。
* unweighted_unifrac_distance_matrix.qza:無權重unifrac距離矩陣。
* bray_curtis_pcoa_results.qza:基於Bray-Curtis距離PCoA的結果。
* jaccard_pcoa_results.qza: jaccard距離PCoA結果。
* weighted_unifrac_pcoa_results.qza:基於有權重的unifrac距離的PCoA結果。unweighted_unifrac_pcoa_results.qza:無權重的unifrac距離的PCoA結果。

### 輸出對象(4種可視化結果):
* bray_curtis_emperor.qzv: Bray-Curtis距離PCoA結果採用emperor可視化。
* jaccard_emperor.qzv: jaccard距離PCoA結果採用emperor可視化。
* weighted_unifrac_emperor.qzv: 有權重的unifrac距離PCoA結果採用emperor可視化。
* unweighted_unifrac_emperor.qzv: 無權重的unifrac距離PCoA結果採用emperor可視化

### Alpha多樣性組間顯著性分析和可視化

qiime diversity alpha-group-significance \
  --i-alpha-diversity core-metrics-results/faith_pd_vector.qza \
  --m-metadata-file metadata.tsv \
  --o-visualization core-metrics-results/faith-pd-group-significance.qzv

qiime diversity alpha-group-significance \
  --i-alpha-diversity core-metrics-results/shannon_vector.qza \
  --m-metadata-file metadata.tsv \
  --o-visualization core-metrics-results/shannon-group-significance.qzv

> 輸出結果：
> shannon-group-significance.qzv 以shannon指數為例探究不同元數據條件下組間差異

### Alpha稀釋曲線
使用qiime diversity alpha-rarefaction可視化工具來探索alpha多樣性與採樣深度的關係。該可視化工具在多個採樣深度處計算一個或多個alpha多樣性指數，範圍介於1（或選擇–p-min-depth進行控制）和最大採樣深度–p-max-depth提供值之間。在每個採樣深度，將生成10個抽樣表，並對錶中的所有樣本進行alpha多樣性指數計算。迭代次數可以通過–p-iterations來控制。

qiime diversity alpha-rarefaction \
--i-table table.qza \
--i-phylogeny rooted-tree.qza \
--p-max-depth 4000 \
--m-metadata-file metadata.tsv \
--o-visualization alpha-rarefaction.qzv

輸出結果：
Alpha rarefaction.qzv查看分組下的3種稀疏箱線圖
> 頂部圖是α稀疏圖(rarefaction plot)，主要用於確定樣品的豐度是否已被完全觀察或測序。如果圖中的線條在沿x軸的某個採樣深度處看起來“平坦”（即斜率接近於零），這表明收集超過該採樣深度的附加序列不太可能觀測到新特徵。如果繪圖中的線條沒有變平，這可能是因為尚未充分觀察樣本的豐富度（由於測序的序列太少），或者可能是在數據中仍然存在許多測序錯誤（被誤認為是新的多樣性） 。
>
> 當通過元數據對樣本進行分組時，底部的繪圖結果非常重要。它說明了當特徵表被細化到每個採樣深度時，每個組中剩餘的樣本數量。如果給定的採樣深度d大於樣本s的總頻率（即針對樣本s獲得的序列數)，則不可能計算採樣深度d下樣本s的多樣性。頂部繪圖將不可靠，因為它將計算基於相對少的樣本。因此當通過元數據對樣本進行分組時，必須查看底部圖表，以確定頂部圖表中顯示的數據是否可靠。
>
> 注意：提供的–p-max-depth參數的值應該通過查看上面創建的table.qzv文件中呈現的“每個樣本的測序量”信息來確定。一般來說，選擇一個在中位數附近的值似乎很好用。如果得到的稀疏圖中的線看起來沒有變平，那麼你可能希望增加該值。如果由於大於最大採樣深度而丟失了許多樣本，則減少該值。

### Beta多樣性組間顯著性分析和可視化

qiime diversity beta-group-significance \
  --i-distance-matrix core-metrics-results/unweighted_unifrac_distance_matrix.qza \
  --m-metadata-file metadata.tsv \
  --m-metadata-column group \
  --o-visualization core-metrics-results/unweighted-unifrac-group-significance.qzv \
  --p-pairwise
  #--p-pairwise参数，执行成对检验，所以这个程序运行得相对较慢

輸出結果：
unweighted-unifrac-group-significance.qzv


### Emperor可視化
> 排序是在樣本元數據分組間探索微生物群落組成差異的流行方法。可以使用Emperor工具在示例元數據下探索主坐標分析（PCoA）繪圖。雖然我們的core-metrics-phylogenetic命令已經生成了一些Emperor圖，但我們希望傳遞一個可選的參數–p-custom-axes，這對於探索時間序列數據非常有用。採於core-metrics-phylogeny的PCoA結果也是一樣的，這使得很容易與Emperor生成新的可視化。

#三维分析图，但由于没有时间序列，故删去第三个参数,生成二维图
qiime emperor plot \   
  --i-pcoa core-metrics-results/bray_curtis_pcoa_results.qza \
  --m-metadata-file metadata.tsv \
  --p-custom-axes group \
  --o-visualization core-metrics-results/bray-curtis-emperor-group.qzv

qiime emperor plot \  
  --i-pcoa core-metrics-results/unweighted_unifrac_pcoa_results.qza \
  --m-metadata-file metadata.tsv \
  --p-custom-axes group \ 
  --o-visualization core-metrics-results/unweighted-unifrac-emperor-group.qzv

輸出結果：
bray_curtis_emperor-group.qzv

unweighted-unifrac-emperor-group.qzv
每一個點代表一個樣本，相同顏色的點來自同一個分組，兩點之間距離越近表明兩者的群落構成差異越小。

### PCA與PCoA的區別：
PCA（Principalcomponent analysis）主成分分析是一種研究數據相似性或差異性的可視化方法，採取降維的思想。PCA可以找到距離矩陣中最主要的坐標，把複雜的數據用一系列的特徵值和特徵向量進行排序後，選擇主要的前幾位特徵值，來表示樣品之間的關係。PC後面的百分數表示對應特徵向量對數據的解釋量，此值越大越好；
PCoA（Principal Co-ordinates Analysis）主坐標分析，與PCA類似，通過一系列的特徵值和特徵向量進行排序後，選擇主要排在前幾位的特徵值，找到距離矩陣中最主要的坐標，結果是數據矩陣的一個旋轉，它沒有改變樣本點之間的相互位置關係，只是改變了坐標系統。
在微生物分析中我們會基於beta多樣性分析得到的距離矩陣，進行PCA和PCoA分析。PCA是基於樣本的相似矩陣（如歐式距離）來尋找主成分，而PCoA是基於相異距離矩陣（歐式距離以外的其他距離，包括binary_jaccard ,bray_curtis ,unweighted_unifrac和weighted_unifrac距離）來尋找主坐標。因此，如果樣本數目比較多，而物種數目比較少，那肯定首選PCA；如果樣本數目比較少，而物種數目比較多，那肯定首選PCoA。