# 總體基因體學介紹 (Metagenomics，或稱宏基因體學)

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## :memo: Where do I start?

### 總體基因體學 (Metagenomics)
* 總體基因體學 (Metagenomics，或稱宏基因體學)是由Handelsman等人於1998年提出的新名詞，指環境中所有生物遺傳物質的總和。近二十年來，總體基因體學逐漸成為一個特別工具，用於研究環境中、人體內等的微生物多樣性和其功能分析，特別是來自於土壤、海洋、空氣、植物和動物腸胃道共生菌等樣品。

* 總體基因體學的研究方向主要為微生物，由於有99%以上的微生物是無法仰賴人工培養的，因此，如果想要描繪真實環境的生化代謝圖譜，最有效的方式就是直接萃取環境中的遺傳物質 (包含DNA與RNA) 加以分析，藉由這些基因體資訊，對環境代謝路徑有通盤了解。

### 總體基因體學的定序策略分成兩大類：
1. **全基因體霰彈槍法(whole genome shotgun sequencing)**
可對特定環境中存在的微生物種類進行全面性分析，但由於目前可用的參考數據庫還很有限，想要分析讀取序列通常仍有困難。
> 適用研究目的: 研究環境微生物之代謝特性與路徑與其種類
2. **16S目標區間定序 (16S targeted sequencing)**
是針對特定高變區(Highly Variable Region)的序列進行定序，執行上相對較容易、快速；但由於只有拿目標區段去做定序，物種分類的解析度也會因此受到限制
> 適用研究目的: 想要了解物種的分布與多樣性


3. **16S / ITS測序與SHOT彈槍宏基因組測序**
如果您的研究需要分類分析以外的基因組分析，例如代謝途徑分析，則應考慮全基因體霰彈槍法測序，因為它具有更大的基因組覆蓋範圍和數據輸出。

4. **Q. Whole metagenomic sequencing (WMS, 總體基因體) 與 amplicon sequencing (16S/18S/ITS) 有什麼不同？**
* Amplicon sequencing 針對高變區定序可鑑別物種與研究多樣性，目前普遍認為可準確到屬層級。
* WMS 則是針對樣本中所有微生物基因體定序，可做功能層級探索，並可準確至種或菌株層級。

### 16S rRNA位在原核細胞的核醣體小次單元(Ribosomal Small Subunit; SSU)上
其序列包含9個高變區(V1~V9)及10個保守區(Conserved Regions)，如下圖圖所示。利用16S rRNA的這些高變區去做定序，可以鑑定微生物的種類。<br>
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> 16S rRNA序列上有10個保守區(以藍色標示)；相較於古菌(Archaea)的菌種，細菌(Bacteria)菌種在保守區上的序列差異並不明顯。而9個高變區(紅色標示的V1~V9區段)則可用來鑑定分類。(圖片來源：EZBioCloud Help center. (2019, Feb. 20). 16S rRNA and 16S rRNA Gene.)

### 定序長度要多少才夠 ?
* 以16S高度變異區域PCR所得到的Amplicon，其增幅片段的長度依據，考量到定序成本問題(長度越長所耗的時間與定序試劑之成本就會越多)，除外，更必須考慮到Amplicon多少長度？才能精確進行物種分類的分析，因此，評估最佳化的條件對於實驗設計是很重要的一件事。Gastroenterol等學者於2010年，針對16S 的Amplicon長度與分類的精準度之間進行比較 (如下圖)，以「屬(genus)」的分類層級來說，200 bases就已達到81.7%的分類準確度，隨長度到400 bases則提升至90%，其後精準度會漸趨於飽和，提升的範圍亦有所限度。綜觀而言，至少200 bases以上之長度，用以進行研究分析，就足以擁有相當準確的分類水準。【World J Gastroenterol 2010; 16(33): 4135-4144】
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### 想要分類鑑定，當然就要用到資料庫
* 目前最常用的資料庫有RDP、SILVA、Greengenes，如表一所示。

> SILVA最搶眼的表現在其可處理的序列量最龐大、且資料庫更新的頻率比其他資料庫快。相對的，Greengenes資料，雖然僅更新到2013年5月，但是它有機會鑑別到「種」的演化層級。(表格來源: 張益祥/ 有勁基因)

1. RDP(全名為Ribosomal Database Project)可用來註釋比對細菌和古菌的16S rRNA序列、以及真菌的28S rRNA序列，共計3,356,809條序列。目前最新版本為2016/09更新的Release 11。

2. SILVA為提供三大界微生物(細菌、古細菌、真核）rRNA基因序列的綜合資料庫；其資料庫涵蓋了原核和真核微生物的核糖體小次單元(即16S rRNA和18S rRNA)以及核糖體大次單元(Ribosomal Large Subunit; LSU，即23S rRNA和28S rRNA)，共計9,469,656條序列。目前最新版本為2019/12更新的SILVA138。

3. Greengenes則是提供細菌、古菌16S rRNA基因序列分析參考的資料庫。目前最新版本為2013/05更新的gg_13_5，共計1,262,986條序列。

> Reference:
> 1. http://www.yourgene.com.tw/content/messagess/contents/655412454415503242/
> 2. http://www.yourgene.com.tw/content/messagess/contents/655643254701452640/