Illumina / 試劑盒
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###### tags: `Illumina`, `基因體`

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Illumina / BaseSpace / Sequence Hub / ==Library Prep Kits==

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**目錄**
[TOC]

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## 術語說明
- ### 試劑 v.s. 試劑盒
- [reagent](https://tw.dictionary.search.yahoo.com/search?p=reagent) 試劑
- [kit](https://tw.dictionary.search.yahoo.com/search?p=kit) 試劑盒
其他稱呼有「試劑組」、「試劑套組」
- 若整個主題沒有提到 reagent，談論的 kit 通常就是指「試劑盒」中的「試劑」
[](https://i.imgur.com/fcdHZpv.jpg)
圖片來源：[Nextera XT DNA Sample Preparation Kit](http://www.gtbiotech.com.tw/products/nextera_xt_dna.asp)
- ### 其他用到的術語
- adapter 定序接頭
- index (樣本的)索引/編號
- probe 探針
- 某種 DNA 片段
- 一小段單鏈 DNA 片段
- 長度約為 10~數百個 鹼基
- 用來檢測與其互補的核酸序列

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## 為什麼需要試劑盒(個人的觀點)
- ### 簡單說明
[](https://i.imgur.com/x37QVNj.jpg)
- 「**試劑盒**」是將「**檢體樣本A**」製作成「**基因庫B**」的工具。<br><br>
- 而「試劑」可以將長鏈的 DNA 片段化
- 並在片段的兩頭接上「樣本索引」與「定序接頭」
- 這樣才可以進行「高通量」定序<br><br>
- 若還是不清楚，可先看一下定序的整個過程：[Illumina / 定序原理](/9fsiG_EUQDyIN7dq6mboGg)
- ### 若沒有「樣本索引」，會有什麼問題？
- 若在定序時，有兩個以上的樣本（同一個或不同個的生物個體）
- 定序出來的結果，就會不知道這個序列的來源
到底是屬於「生物個體1」的？
還是屬於「生物個體2」的？
- ### 若沒有「定序接頭」，會有什麼問題？
- 流動池(晶片)上面的互補「定序接頭」，就無法抓住 DNA 片段
- 抓不到 DNA 片段，就無法進行橋式 PCR 來大量複製 DNA 片段
- 也就無法進行「高通量」定序
- ### 關於 DNA 片段化
- 透過試劑打斷，可以獲得長度均勻分佈的 DNA 片段
- 若透過超音波打斷，可能獲得大小不一，長度不均勻的 DNA 片段

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## 試劑在反應的過程，又叫做 [Multiplexing](https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/plan-experiments/multiplex-sequencing.html)
- ### 名詞解釋
- [multiplex](https://tw.dictionary.search.yahoo.com/search?p=multiplex) [ˋmʌltə͵plɛks] v. 多路傳輸
- [demultiplex](https://tw.dictionary.search.yahoo.com/search?p=demultiplex) [ˋmʌltə͵plɛks] v. 多路分配
(信號分離/[解編](http://terms.naer.edu.tw/detail/2919168/), Illumina 官方翻譯)
- ### 簡單說明
- **multiplex**
在基因庫製作的過程(Prep / Manual / Step2)
也就是：將多個樣本貼上條碼，混合平行定序
- **demultiplex**
將 base call 的 BCL 檔，轉成 fastq 的過程
也就是：定序後的結果，根據條碼，依原本的樣本類別進行分類
- ### 圖解流程說明
[](https://i.imgur.com/x37QVNj.jpg)
- **==[A: multiplex]==**
Two representative DNA fragments from two unique samples, each attached to a specific barcode sequence that identifies the sample from which it originated.
來自兩個獨特生物樣本的兩個代表性 DNA 片段，每個片段都接上特定的條碼序列，以識別其來源的樣品。
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- **[B]** Libraries for each sample are pooled and sequenced in parallel. Each new read contains both the fragment sequence and its sample-identifying barcode.
每個生物樣本的基因庫被合併，並平行定序。每一條新的讀數都包含片段序列及樣品識別條碼。
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- **[C: demultiplex]**
Barcode sequences are used to de-multiplex, or differentiate reads from each sample.
條碼序列用於信號分離(解編)，或是作為區分每個樣本的讀數用
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- **[D]** Each set of reads is aligned to the reference sequence.
每組讀數均與參考序列比對

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## 製備試劑有很多種
- [PCR Kit](https://www.gendiscovery.com.tw/pcr)
- [Real Time PCR (qPCR) Kit](https://www.gendiscovery.com.tw/real-time-pcr)
- [Reverse transcription PCR Kit](https://www.gendiscovery.com.tw/rt-pcr)
- [PCR 純化/添加劑](https://www.gendiscovery.com.tw/pcr-additive)
- ...

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## 產品規格的解讀
- ### [Nextera XT DNA Sample Preparation Kit](http://www.gtbiotech.com.tw/products/nextera_xt_dna.asp)
Nextera = next [era](https://tw.dictionary.search.yahoo.com/search?p=era) = 下一個世代
- #### Sample DNA input type (樣品 DNA 輸入類型)
> DNA 可以是 基因體DNA, PCR放大片段/PCR擴增子, [質體(plasmids)](https://zh.wikipedia.org/wiki/%E8%B4%A8%E7%B2%92)
- #### Input DNA (輸入 DNA)
> 僅需 1ng(奈克) 的 DNA 進樣量，微量即可進行製備
- #### Typical median insert size (插入片段序列長度的典型中位數)
> 被切斷的 DNA 片段中，其片段長度的中位數將不到 300 個鹼基
- #### Available indices (可用的索引)
> DNA 片段的兩端索引序列接頭，分別有 8 種和 12 種的索引
> 兩端組合在一起，可以有 8 x 12 = 96 種組合
> 因此，一次可以定序 96 個樣本
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> 專業的講法：
> 搭配 Dual index 的設計，分別在 3’ 端和 5’ 端 Adaptor 序列中設計8種和12種的index序列，經由排列組合後，可以支援到96種樣品在一次定序實驗中同時進行。
- #### Compatible sequencers (相容的定序儀)
- [HiSeq](http://www.gtbiotech.com.tw/products/pd_hiseq4k.asp?item9=,1)
- [HiScanSQ](http://www.gtbiotech.com.tw/products/hiscansq.asp)
- [Genome Analyzer Iix](http://www.gtbiotech.com.tw/products/pd_sq_ga2.asp)
- #### Read lengths supported (支援讀數長度)
> 在任一 Illumina 定序系統上，均支援讀數長度

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## 試劑反應的示意圖之一
- ### [Nextera Flex for Enrichment](http://www.gtbiotech.com.tw/products/pd_enr.asp?item13=,1)
[](https://i.imgur.com/DWzL6nS.jpg)
- #### 產品特色
- 加速及簡化「捕捉目標基因(Capture-based)」類型的定序樣品製備流程
- 其利用創新BLT(bead-linked transposome)技術將磁珠上的Transposome和DNA樣品均勻地進行反應，整合DNA片段化(tagmentation)到濃度均一化(normalization)等步驟，可簡化繁瑣的手動操作流程。
- 後續搭配各式專一性探針捕捉感興趣的基因區段進行定序，適合製備定序區域較大的樣品（如人類全外顯子區域或神經退化性疾病關聯基因）
- 可在90分鐘內完成雜合反應，將樣品製備時間從2天縮短至6.5小時
- on-target rate 可達到85%以上，大幅提升實驗效率。
- #### 適用於
- 科研與臨床檢體的需求，如血液、唾液、福馬林包埋組織等樣品

## 與試劑相關的文章
- ### [【有勁生物科技】科學研究 定序委託單附件](http://www.yourgene.com.tw/webtools/thumbnail/download/707271216361443137/?fd=Messagess_Flies&Pname=%E7%A7%91%E5%AD%B8%E7%A0%94%E7%A9%B6_3_%E5%AE%9A%E5%BA%8F%E5%A7%94%E8%A8%97%E5%96%AE%E9%99%84%E4%BB%B6_v5.pdf)
[](https://i.imgur.com/YU4mIz9.png)
- ### [Long fragment reads技術在次代定序儀上的應用](https://yourgene.pixnet.net/blog/post/114396053)
- 商品名稱： TruSeq synthetic long read (TSLR) technology
- Illumina 發展出新的 library 製備方式
- 定序結果近似第三代定序儀讀長的結果
- 能追溯親代基因型的遺傳
- 短中長序列
- kb等級：長片段序列
- mb等級：中片段序列
- < 100base：短片段序列
- 製備策略
- 使用 g-TUBE 剪切成 Kb 為單位長短不一的 DNA 片段
- 由 phi29 polymerase 製造出的片段大小範圍即 30-300 Kb
- 接著全被接上 adapter
- 再切膠篩選出 8-10Kb 的片段
- keywords: 第三代, 第3代, 定序, 試劑, g-tube
- ### [PCR-Free (Amplification-Free)](https://yourgene.pixnet.net/blog/post/78072060)
- PCR-Free
- 不經 PCR 步驟而完成基因庫建構(library construction)
- 基因庫建構的過程，可能會產下底下錯誤
- 因 primer 與 template 互補配對，造成配對錯誤導致 bias 產生
- 濃度過高的 primer 與 DNA template，會形成 dulplicate
- Adapter dimer (轉接子雙體)
([圖片來源](https://www.nvigen.com/dna-clean-up/))
> https://www.nvigen.com/dna-clean-up/
> 確認核酸片段庫是否有接合體雙體 (adapter dimer) 存在，光靠定量是無法分辨，進而影響定序資料量
- PCR 產生的偏差問題
- 在進行 PCR 的同時並非每一段序列都會均勻被放大
- 也就是說 PCR 的效率可能是不平均的
- 因此造成 coverage 分佈不均的情況，進而會影響 genome assembly
- 不同的試劑，可以產生不同覆蓋度的測序片段
- ### [Hieff NGSTM DNA Selection Beads (DNA分选磁珠)](http://www.labbase.net/News/ShowNewsDetails-2-60-709B88BACC53203A.html)
- 精準分選
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- ### [Next-Generation Sequencing - Innovative solutions with SMART technology](http://www.unimed.com.tw/tmpFile/TC_NGS_S.pdf)