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# System prepended metadata

title: ANNOVAR for mm9
tags: [mm9, 基因體/三級分析, 基因體, Annovar, 三級分析, 生物資訊, Mus musculus]

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ANNOVAR for mm9
===
###### tags: `基因體/三級分析`
###### tags: `生物資訊`, `基因體`, `三級分析`, `Annovar`, `mm9`, `Mus musculus`

<br>

[TOC]

<br>

## 標記對象
![](https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c4/Maus_im_Haus.JPG/640px-Maus_im_Haus.JPG)
- 學名
    - Mus musculus (小家鼠)
- Wiki
    - https://zh.wikipedia.org/wiki/%E5%B0%8F%E5%AE%B6%E9%BC%A0

<br>

## Step0 - 要標注什麼？（宏觀概念）
- 輸入 / 輸出
    - **input**
        ```
        1    19215217    19215217    T  C
        1    33803084    33803084    A  G
        1    33803198    33803198    A  G
        1    37499237    37499237    T  C
        1    37499238    37499238    T  C
        1    37500003    37500003    T  C
        1    43826936    43826936    T  C
        1    58853960    58853960    A  G
        1    58854487    58854487    A  G
        1    60436865    60436865    T  C
        ```
        - 已知：
            - 染色體編號
            - 起始/結束位置
            - SNP & Indel 變異資訊
        <br>
    - **output**
        ```
        intronic    Tfap2b	1    19215217    19215217    T  C
        UTR3        Bag2	1    33803084    33803084    A  G
        UTR3        Bag2	1    33803198    33803198    A  G
        UTR3        Mgat4a	1    37499237    37499237    T  C
        UTR3        Mgat4a	1    37499238    37499238    T  C
        UTR3        Mgat4a	1    37500003    37500003    T  C
        intronic    Uxs1	1    43826936    43826936    T  C
        intronic    Casp8	1    58853960    58853960    A  G
        intronic    Casp8	1    58854487    58854487    A  G
        intronic    Cyp20a1	1    60436865    60436865    T  C
        ```
    - 需要哪些資料，才能對個體進行標記？
        - 「已標記過」的群體資料
            ```
            172	NM_001145824	chr2	-	104266638	104334646	104270011	104312002	16	104266638,104270883,104271308,104273324,104273711,104274494,104274746,104275092,104277153,104278007,104279386,104280362,104281401,104286668,104310905,104334104,	104270488,104271011,104271544,104273465,104274002,104274656,104274871,104275214,104277277,104278164,104279571,104280449,104281521,104286792,104312004,104334646,	0	Hipk3	cmpl	cmpl	0,1,2,2,2,2,0,1,0,2,0,0,0,2,0,-1,
            ```
            [![](https://i.imgur.com/7PaflTN.png)](https://i.imgur.com/7PaflTN.png)
            - [基因名稱(Name of gene) 的代碼](https://asia.ensembl.org/info/genome/genebuild/annotation_sources.html)
                - NM_：known mRNA (已知 mRNA)
                - NP_：known protein (已知蛋白質)
                - XM_：predicted mRNA (預測的 mRNA, 未知 mRNA)
                - XP_：predicted protein (預測的蛋白質, 未知蛋白質)
            - [其他代碼](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK50679/)
                - NC_ represent the finished genome and plasmids
                    (表示完成的基因組和質粒)
                - NG_：non-transcribed pseudogenes or genomic regions
                    (非轉錄的假基因或基因體區域)
                - XR_：non-coding RNA (非編碼RNA)
            - 完整代碼清單
                - [[Wiki] RefSeq](https://en.wikipedia.org/wiki/RefSeq)
                - [[NCBI手冊] 第18章 - 參考序列（RefSeq）資料庫庫](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/table/ch18.T.refseq_accession_numbers_and_mole/?report=objectonly)
            <br>
        - mRNA 參考序列（群體）

<br>

## Step1 - 下載 Annovar 工具
- 請參考 [ANNOVAR](https://hackmd.io/VdHP3H1ARIiZkSrG-MXvDQ)

<br>

## Step2 - 下載「已標記過」的群體資料（不含 DNA 序列）
- **目的**
    - 根據「已標記過」的群體資料，對待測個體的基因，進行標記

- **環境預備**
    - **先進入到 annovar 資料夾**
        ```
        # 預期至少會有底下 4 支基本的 perl 檔 (舊版＆新版共有的)
        
        annovar
        ├── annotate_variation.pl
        ├── coding_change.pl
        ├── convert2annovar.pl
        └── retrieve_seq_from_fasta.pl
        ```
        隨後的「指令」與「建立的資料夾」，都是以 annovar 資料夾為基準
        <br>
    - **建立子資料夾 mousedb，用來儲放老鼠的基因庫**

        ```
        annovar
        ├── humandb
        │   ├── ...
        │   └── hg19_refGene.txt
        ├── mousedb
        │   ├── ...
        │   └── mm9_refGene.txt
        ├── pigdb
        │   ├── ...
        │   └── susScr11_refGene.txt
        ```
        - 如果是人類，通常就建立 humandb
        - 如果是老鼠，就建立 mousedb
        - 如果是豬隻，就建立 pigdb
        - 以此類推（或是建立自己喜歡的名稱）
        <br>
- **指令**
    - **[方法一]** 透過 Annovar 官網定義的代碼下載
        ```perl
        ./annotate_variation.pl -buildver mm9 -downdb -webfrom annovar refGene mousedb
        ```
        - ```./annotate_variation.pl```
            - ```-buildver mm9``` (版本：mm9)
            - ```-downdb -webfrom annovar refGene``` (來源：annovar)
            - ```mousedb``` (用來存放相關 db 的資料夾名稱，用「本地端 db」來稱呼)
        <br>
    - **[方法二]** 直接從 UCSC 抓取
        ```perl
        ./annotate_variation.pl -buildver mm9 -downdb refGene mousedb.2
        ```
        - ```./annotate_variation.pl```
            - ```-buildver mm9``` (版本：mm9)
            - ```-downdb refGene``` (來源：UCSC)
            - ```mousedb``` (用來存放相關 db 的資料夾名稱，用「本地端 db」來稱呼)
        <br>
        - 不管來源是 Annovar, 或是 UCSC，看不出兩者的資料差異。
            兩者皆是從
            ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/refGene.txt.gz
            抓取
        <br>
        - 抓取後，會將 refGene.txt.gz 解壓縮，並放在 mousedb 下
            檔案名稱的前綴，會加上 buildver，變成 mm9_refGene.txt
            ```
            annovar
            ├── mousedb
            │   └── mm9_refGene.txt
            ```
        <br>
    - 所以，你可以：
        **[方法三]** 直接從 UCSC 的 [ftp](ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/) 手動抓取
        或是 **[方法四]** 透過 wget 抓取
        ```bash
        # download:
        wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/refGene.txt.gz
        
        # decompress:
        # -k, --keep: keep (don't delete) input files
        # -d, --decompress  decompress
        gzip -kd refGene.txt.gz
        ```

<br>

## Step3 - 下載老鼠的 DNA 參考序列（群體）
- **目的**
    - 用來提取「群體的參考序列」，後續可用來重建「標記過的特徵序列」
    <br>
- **指令**
    ```
    ./annotate_variation.pl -buildver mm9 -downdb seq mousedb/mm9_seq
    ```
    - ```./annotate_variation.pl```
        - ```-buildver mm9``` (版本：mm9)
        - ```-downdb seq``` (來源：UCSC)
        - ```mousedb/mm9_seq``` (將序列資料存放在此)

        ```
        annovar
        ├── mousedb
        │   ├── mm9_refGene.txt
        │   └── mm9_seq
        │       ├── chromFa.tar.gz (原始檔，底下為解壓縮)
        │       ├── chr1.fa
        │       ├── chr1_random.fa
        │       ├── chr2.fa
        │       ├── ...
        │       ├── chr19.fa
        │       ├── ...
        │       ├── chrM.fa
        │       ├── chrUn_random.fa
        │       ├── chrX.fa
        │       ├── chrX_random.fa
        │       ├── chrY.fa
        │       └── chrY_random.fa
        ```
    - 或是直接由 UCSC 的 [ftp](ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/bigZips/) 下載
        ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/bigZips/chromFa.tar.gz
        > README: chromFa.tar.gz
        > The assembly sequence in one file per chromosome.
        > Repeats from RepeatMasker and Tandem Repeats Finder 
        > (with period of 12 or less) are shown in lower case; 
        > non-repeating sequence is shown in upper case.
    - fa 檔案內容
        ![](https://i.imgur.com/HF43ArI.png)
        - 可以想像成：以前 email 格式
        - [[Wiki] FASTA格式](https://zh.wikipedia.org/wiki/FASTA%E6%A0%BC%E5%BC%8F)
            ```fasta
            > 這是註解，用來描述序列的相關資訊，只限單行
            序列1
            序列2
            序列3
            ...
            (每行序列最好不要超過 80 行，超過就切到下一行)
            ```
        - 不只用來存放 A/C/T/G，也可以用來存放胺基酸序列
            ```
            >P01013 GENE X PROTEIN (OVALBUMIN-RELATED)
            QIKDLLVSSSTDLDTTLVLVNAIYFKGMWKTAFNAEDTREMPFHVTKQESKPVQMMCMNNSFNVATLPAE
            KMKILELPFASGDLSMLVLLPDEVSDLERIEKTINFEKLTEWTNPNTMEKRRVKVYLPQMKIEEKYNLTS
            VLMALGMTDLFIPSANLTGISSAESLKISQAVHGAFMELSEDGIEMAGSTGVIEDIKHSPESEQFRADHP
            FLFLIKHNPTNTIVYFGRYWSP
            ```

<br>

## Step4 - 重建「已標記過的特徵序列」
- **真正說法**
    - 重新建構成「老鼠轉錄表達基因fasta格式文件」
- **目的**
    - 供檢測 DNA 序列相似度(?)
- **指令**
    ```
    ./retrieve_seq_from_fasta.pl mousedb/mm9_refGene.txt --format refGene --seqdir mousedb/mm9_seq/ --outfile mousedb/mm9_refGeneMrna.fa
    ```
    - ```./retrieve_seq_from_fasta.pl```
        - Input:
            - ```mousedb/mm9_refGene.txt``` (「已標記過」的群體資料)
            - ```--format refGene```
            - ```--seqdir mousedb/mm9_seq/``` (群體的參考序列)
        - Output:
            - ```--outfile mousedb/mm9_refGeneMrna.fa```
- **重建結果 (mm9_refGeneMrna.fa)**
    - **NM_001145824** ([NCBI](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001145824))
    >\>NM_001145824   Comment: this sequence (leftmost exon at chr2:104266638) is generated by ANNOVAR on Mon Aug 19 15:09:38 2019, based on re
    gions speficied in mousedb/mm9_refGene.txt and sequence files stored at mousedb/mm9_seq/.
    GGCGGCCGAGGCCGGCGGGCGCGCGGAGGAGGGGCCCGATATCGGGGCG
    GCCTGCCGCAGCTGCCCGGGTGACGACTGCCGGCAGCGCGGCGCCCCGA
    ...
    GTGTATTACTGTTGATTCACTTTGAATTAAAATATATATATTGCGGCAA
    <br>
    
    ![](https://i.imgur.com/7PaflTN.png) 
    <br>
    - **NM_001177756** ([NCBI](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001177756))
    >\>NM_001177756   Comment: this sequence (leftmost exon at chr2:11393057) is generated by ANNOVAR on Mon Aug 19 15:09:38 2019, based on reg
    ions speficied in mousedb/mm9_refGene.txt and sequence files stored at mousedb/mm9_seq/.
    GCCGCGCTACCGGTCAGATCTTAAAAGGCCGGGCAGTGCGTGTGGCATC
    CCGACAGAACTGGAGAGGAGCAAGTGGCAGTGCTGGGTGTTGGGACCGT
    ...
    TTGTCAAGTTTGTATATTTAGGAAATATAATAAAATGTGTTAATTTTAA
    <br>
    
    - (more)
    ![](https://i.imgur.com/5nWn65g.png)

<br>

## Step5 - 對老鼠個體進行標記
- **輸入範例：**
    ```test.input.txt```
    ```
    1       19215217  19215217        T  C
    1       33803084  33803084        A  G
    1       33803198  33803198        A  G
    1       37499237  37499237        T  C
    1       37499238  37499238        T  C
    1       37500003  37500003        T  C
    1       43826936  43826936        T  C
    1       58853960  58853960        A  G
    1       58854487  58854487        A  G
    1       60436865  60436865        T  C
    ```
    - 染色體編號
    - 染色體上的起始位置
    - 染色體上的結束位置
    - 參考基因組鹼基
    - 變異鹼基
    <br>
- **輸出結果**
    ```test.variant_function```
    ```
    intronic  Tfap2b     1  19215217  19215217  T  C
    UTR3      Bag2       1  33803084  33803084  A  G
    UTR3      Bag2       1  33803198  33803198  A  G
    UTR3      Mgat4a     1  37499237  37499237  T  C
    UTR3      Mgat4a     1  37499238  37499238  T  C
    UTR3      Mgat4a     1  37500003  37500003  T  C
    intronic  Uxs1       1  43826936  43826936  T  C
    intronic  Casp8      1  58853960  58853960  A  G
    intronic  Casp8      1  58854487  58854487  A  G
    intronic  Cyp20a1    1  60436865  60436865  T  C
    ```
    - **基因區段 (基因功能區)** ([Annovar:Help](http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/gene/))
        ![](https://i.imgur.com/jKyLGs8.png)
            ([圖片來源](https://zh.wikipedia.org/wiki/%E9%9D%9E%E7%BF%BB%E8%AF%91%E5%8C%BA))
        ![](https://i.imgur.com/CAcNTUQ.png)
            ([圖片來源](https://zoro.ee.ncku.edu.tw/mlb2011/res/proj1/5.pdf))
        
        - **exonic & intronic**: 
            Exonic region, 外顯子區段（外顯子編碼胺基酸的區域）
            Intronic region, 內含子區段
            
        - **UTR3 & UTR5**: 
            3' UTR, 3' untranslated region, 3' 非轉譯區
            5' UTR, 5' untranslated region, 5' 非轉譯區
            
        - **upstream & downstream**:
            ![](https://i.imgur.com/Uplcwap.jpg)
            ([圖片來源](http://blog.sina.com.cn/s/blog_4b07ffbc01016r71.html))
            
            編碼順序：[上游][5'端] ---> [3'端][下游]
            
            [Bag2](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/213539)：[downstream][UTR3]...[UTR5][upstream]
                - 33802328 downstream
                - 33802329 UTR3 
                - ...
                - 33814595 UTR5 
                - 33814596 upstream 
            
            upstream, 起始密碼子之前的基因(?)
            upstream region, 上游區域
            downstream region, 下游區域
            
            題外話：[調控基因](https://baike.baidu.com/item/%E5%90%AF%E5%8A%A8%E5%AD%90)
            ![](https://gss0.bdstatic.com/-4o3dSag_xI4khGkpoWK1HF6hhy/baike/c0%3Dbaike80%2C5%2C5%2C80%2C26/sign=67769bff34d12f2eda08a6322eabbe07/c995d143ad4bd1136f6a4d1a58afa40f4bfb0576.jpg)
            
            
        - **splicing & ncrna**:
            - ncrna: 
                - ncRNA
                - non-coding RNA
                - [非編碼核糖核酸](https://zh.wikipedia.org/wiki/%E9%9D%9E%E7%B7%A8%E7%A2%BC%E6%A0%B8%E7%B3%96%E6%A0%B8%E9%85%B8)
                - 同義詞
                    - 非信使核糖核酸
                - 定義
                    - 不轉譯成蛋白質的RNA分子
                - 功能
                    - 生產 tRNA（轉移RNA）
                    - rRNA（核糖體RNA）
                    - 一些小RNA
            
        - **integenic**: 
            Intergenic region, 基因間區段
        <br>
    - **基因名稱**
        - [Bag2](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/213539)
        - [Mgat4a](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/269181)
        - [Casp8](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/12370)
    - 染色體編號
    - 染色體上的起始位置
    - 染色體上的結束位置
    - 參考基因組鹼基
    - 變異鹼基

<br>

## 標記後的資料，意味著什麼？
- 標記名稱
- [BRCA1和BRCA2基因與致癌機轉](https://blog.xuite.net/chingshengyeh/blog/116965680)
    - ### 點突變
        - BRCA1 發生 M1775R 的點突變時，也是致病性的突變
            - [NM_007294.3(BRCA1):c.5324T>G (p.Met1775Arg)](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/17694/)
        - BRCA1 發生 S1613G 的點突變時，則是良性的基因變異，與致癌無關。
            - [NM_007294.3(BRCA1):c.4837A>G (p.Ser1613Gly)](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/41827/)
    - ### 基因體資訊
        ![](https://i.imgur.com/7dGuTky.jpg)
        - BRCA1 ([Wiki](https://en.wikipedia.org/wiki/BRCA1))
            - BRCA1 有 24 個 exon
            - 轉譯而成的 BRCA1 蛋白質共有 1863 個胺基酸
        - BRCA2 ([Wiki](https://en.wikipedia.org/wiki/BRCA2))
            - BRCA2 有 27 個 exon
            - 轉譯而成的 BRCA2 蛋白質共有 3418 個胺基酸

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## 參考資料
- [[台部落] Annovar 軟件註釋流程](https://www.twblogs.net/a/5b7fe56d2b717767c6b25d06)