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Análisis de secuencias de amplicones del gen rRNA 16S con QIIME2

Dra. E. Ernestina Godoy Lozano
elizabeth.godoy@insp.mx
tinagodoy@gmail.com

Temario

Crear espacio de trabajo

Ejercicio 1. Conectarnos al servidor

ssh -X alumnoX@132.248.32.180

Ejercicio 2: Crear mi espacio de trabajo

Ir a mi home

cd

Crear directorio de trabajo




mkdir EMetagen
cd EMetagen
mkdir qiime2

Explorar los datos que usaremos

Ejercicio 3: Listado de archivos

Manifiesto y Metadatos




ls /Share/EMetagen/data
cat /Share/EMetagen/data/metadata.tsv
cat /Share/EMetagen/data/manifiesto.csv

Secuencias crudas



ls /Share/EMetagen/raw_data
head /Share/EMetagen/raw_data/Cru1_S1_SED_R1.fastq

Contar secuencias crudas

grep -c '^+' /Share/EMetagen/raw_data/*.fastq

Base de datos

ls /Share/EMetagen/database

Activar ambiente conda QIIME2

Ejercicio 4: Ambiente conda de QIIME2




export LC_ALL=C.UTF-8
export LANG=C.UTF-8
conda activate qiime2-2021.8

Ejercicio 5: Visualizar los plugins instalados

qiime --help

Ejercicio 6: Visualizar la ayuda de un plugin

qiime taxa --help

Visualizar la ayuda de un comando en especifico del plugin

qiime taxa barplot --help

Análisis de amplicones de rRNA 16S

Ejercicio 7: Convertir archivo de metadata a qzv

Tiempo aprox 5 a 10 seg






# Acceder al directorio qiime2
cd qiime2
qiime metadata tabulate \
--m-input-file /Share/EMetagen/data/metadata.tsv \
--o-visualization 1.metadata.qzv

Ejercicio 8: Visualizar el archivo metadata.qzv

Opcion1. A través de qiime tools view

# qiime tools view 1.metadata.qzv

Opcion2. Descargando el archivo a mi computadora por medio del comando scp

  1. Dentro de mi computadora, abrir otra pestaña de la consola.
  2. Cambiar de directorio a donde quiero descargar los resultados.
  3. Descargar archivo por medio del comando de copia de segurida scp.
scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/1.metadata.qzv .
  1. En mi navegador ir a la pagina web https://view.qiime2.org/
  2. Abrir el archivo. Podemos arrastrarlo.
  3. Visualizar archivo.

Ejercicio 9: Importar mis datos a QIIME2

Tiempo aprox 30 a 40 seg






qiime tools import \
--type SampleData[PairedEndSequencesWithQuality] \
--input-format PairedEndFastqManifestPhred33 \
--input-path /Share/EMetagen/data/manifiesto.csv \
--output-path 2.demux.qza

Ejercicio 10: Generar la visualización de mis datos




qiime demux summarize \
--i-data 2.demux.qza \
--o-visualization 2.demux.qzv

Descargar el archivo para observarlo en https://view.qiime2.org/

scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/2.demux.qzv .

Ejercicio 11: Eliminación de errores (denoising) y la clusterización con DADA2

Tiempo aprox 60 a 70 seg








qiime dada2 denoise-paired \
--i-demultiplexed-seqs 2.demux.qza \
--p-trunc-len-f 295 \
--p-trunc-len-r 240 \
--o-table 3.table.qza \
--o-representative-sequences 3.rep-seqs.qza \
--o-denoising-stats 3.denoising-stats.qza

Generamos el archivo para visualización

Tiempo aprox 8 a 10 seg




qiime metadata tabulate \
--m-input-file 3.denoising-stats.qza \
--o-visualization 3.denoising-stats.qzv

Descargar el archivo para observarlo en https://view.qiime2.org/

scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/3.denoising-stats.qzv .

Ejercicio 12: Generar visalización de las secuencias representativas (FeatureData)

Tiempo aprox 40 a 45 seg




qiime feature-table tabulate-seqs \
--i-data 3.rep-seqs.qza \
--o-visualization 4.rep-seqs.qzv

Exportando las secuencias representativas en formato fasta

Tiempo aprox 8 a 10 seg




qiime tools export \
--input-path 3.rep-seqs.qza \
--output-path 4.RepSeqFasta

Descargar el archivo para observarlo en https://view.qiime2.org/

scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/4.rep-seqs.qzv .

Ejercicio 13: Generar la tabla de abundancias absolutas (FeatureTable)

Tiempo aprox 40 a 45 seg





qiime feature-table summarize \
--i-table 3.table.qza \
--o-visualization 3.table.qzv \
--m-sample-metadata-file /Share/EMetagen/data/metadata.tsv

Descargar el archivo para observarlo en https://view.qiime2.org/

scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/3.table.qzv .

Ejercicio 14: Asignacion taxonómica usando BLAST+

Tiempo aprox 8 a 10 min
NOTA: No lo correremos porque el servidor se satura






#qiime feature-classifier classify-consensus-blast \
#--i-query 3.rep-seqs.qza \
#--i-reference-reads /Share/EMetagen/database/silva_132_99_16S.qza \
#--i-reference-taxonomy /Share/EMetagen/database/majority_taxonomy_7_levels.qza \
#--o-classification 5.taxonomy_blast.qza

Copiar la anotación taxonómica

cp /home/tina/EMetagen/qiime2/5.taxonomy_blast.qza .

Generamos el archivo para visualización

Tiempo aprox 8 a 10 seg




qiime metadata tabulate \
--m-input-file 5.taxonomy_blast.qza \
--o-visualization 6.taxonomy_blast.qzv

Descargar el archivo para observarlo en https://view.qiime2.org/

scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/6.taxonomy_blast.qzv .

Generamos un archivo de gráficas apiladas (barplots)

Tiempo aprox 5 a 8 seg






qiime taxa barplot \
--i-table 3.table.qza \
--i-taxonomy 5.taxonomy_blast.qza \
--m-metadata-file /Share/EMetagen/data/metadata.tsv \
--o-visualization 7.taxa-bar-plots_blast.qzv

Descargar el archivo para observarlo en https://view.qiime2.org/

scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/taxa-bar-plots_blast.qzv .

Ejercicio 15: FeatureTable a formato BIOM

Tiempo aprox 8 a 10 seg

Formato BIOM




qiime tools export \
--input-path 3.table.qza \
--output-path 8.taxa_levels

Explorar el directorio de 8.taxa_levels

ls 8.taxa_levels/

Exportar el archivo de taxonomía a archivo tabular

Tiempo aprox 5 a 8 seg




qiime tools export \
--input-path 5.taxonomy_blast.qza \
--output-path 8.taxa_levels

Explorar el directorio de 8.taxa_levels

ls 8.taxa_levels/

Agregando la información de la asignación taxonómica a la tabla con formato BIOM

Tiempo aprox 5 a 8 seg







biom add-metadata \
-i ./8.taxa_levels/feature-table.biom \
-o ./8.taxa_levels/tableConTax.biom \
--observation-metadata-fp ./8.taxa_levels/taxonomy.tsv \
--observation-header OTUID,taxonomy \
--sc-separated taxonomy

Explorar el directorio de 8.taxa_levels

ls 8.taxa_levels/

Convertir el archivo BIOM a un archivo de texto tabular

Tiempo aprox 5 a 8 seg






biom convert \
-i ./8.taxa_levels/tableConTax.biom \
-o ./8.taxa_levels/TablaFinal.txt \
--to-tsv \
--header-key taxonomy

Explorar el directorio de 8.taxa_levels

ls 8.taxa_levels/

Explorar la TablaFinal.txt

less -S 8.taxa_levels/TablaFinal.txt

Ejercicio 16: Reconstrucción filogenética para los análisis de diversidad

Tiempo aprox 8 a 10 seg







qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
--i-sequences 3.rep-seqs.qza \
--o-alignment 9.aligned-rep-seqs.qza \
--o-masked-alignment 9.masked-aligned-rep-seqs.qza \
--o-tree 9.unrooted-tree.qza \
--o-rooted-tree 9.rooted-tree.qza

Descargas

  1. Descargar el archivo del árbol para observarlo en iTOL (https://itol.embl.de/)
  2. Es necesario descargar el archivo 5.taxonomy_blast.qza para cambiar las anotaciones en itol




# Árboles
scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/*rooted-tree.qza .
# Taxonomía
scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/5.taxonomy_blast.qza .

Ejercicio 17: Gráficas de rarefacción

Tiempo aprox 40 a 50 seg







qiime diversity alpha-rarefaction \
--i-table 3.table.qza \
--i-phylogeny 9.rooted-tree.qza \
--p-max-depth 60 \
--m-metadata-file /Share/EMetagen/data/metadata.tsv \
--o-visualization 10.alpha-rarefaction.qzv

Descargar el archivo para observarlo en https://view.qiime2.org/

scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/10.alpha-rarefaction.qzv .

Ejercicio 18: Métricas de alfa y beta diversidad

Tiempo aprox 8 a 10 seg







qiime diversity core-metrics-phylogenetic \
--i-phylogeny 9.rooted-tree.qza \
--i-table 3.table.qza \
--p-sampling-depth 60 \
--m-metadata-file /Share/EMetagen/data/metadata.tsv \
--output-dir 11.core_metrics_results

Descargas

  1. Descargar los archivos .qzv para observarlos en https://view.qiime2.org/
  2. En mi computadora personal crear un directorio y entrar a el para comenzar la descarga



mkdir 11.core_metrics_results
cd 11.core_metrics_results
scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/11.core_metrics_results/*.qzv .

Alfa diversidad

Explorar el índice de Shannon

Tiempo aprox 5 a 8 seg





qiime diversity alpha-group-significance \
--i-alpha-diversity 11.core_metrics_results/shannon_vector.qza \
--m-metadata-file /Share/EMetagen/data/metadata.tsv \
--o-visualization 11.core_metrics_results/shannon-group-significance.qzv

Descargar el archivo para observarlo en https://view.qiime2.org/

scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/11.core_metrics_results/shannon-group-significance.qzv .

Beta diversidad

Explorar las distancias por el metodo "unweighted unifrac" por la variable "Type"

Tiempo aprox 5 a 8 seg







qiime diversity beta-group-significance \
--i-distance-matrix 11.core_metrics_results/unweighted_unifrac_distance_matrix.qza \
--m-metadata-file /Share/EMetagen/data/metadata.tsv \
--m-metadata-column Type \
--p-pairwise \
--o-visualization 11.core_metrics_results/uw_unifrac-delivery-significance.qzv

Descargar el archivo para observarlo en https://view.qiime2.org/

scp -r alumnoXX@132.248.32.180:/home/alumnoXX/EMetagen/qiime2/11.core_metrics_results/uw_unifrac-delivery-significance.qzv .

Desactivar el ambiente de conda

conda deactivate

Ejercicios extra

Colapsar la tabla a un nivel taxonómico específico (género; nivel 6)

Tiempo aprox 5 a 8 seg

Entrar al directorio de trabajo:








cd EMetagen/qiime2

qiime taxa collapse \
--i-table 3.table.qza \
--i-taxonomy 5.taxonomy_blast.qza \
--p-level 6 \
--o-collapsed-table 8.taxa_levels/table_level6_genus.qza

Exportando la tabla colapsada a formato BIOM

Tiempo aprox 5 a 8 seg




qiime tools export \
--input-path 8.taxa_levels/table_level6_genus.qza \
--output-path level6_Genus

Explorar el directorio de level6_Genus

ls level6_Genus/

Convertir los datos BIOM a archivo de texto tabular

Tiempo aprox 5 a 8 seg





biom convert \
-i ./level6_Genus/feature-table.biom \
-o ./level6_Genus/CollapsedTaxonomy_level6_Genus.tsv \
--to-tsv

Explorar el directorio de level6_Genus



ls level6_Genus/
less -S level6_Genus/CollapsedTaxonomy_level6_Genus.tsv

Información complementaria

-Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2
-Instalación de QIIME2
-Canal QIIME2 en youtube
-Tutorial pd-mice QIIME2

tags: Bitácoras UUASMB Metagenómica
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Tina Godoy
Head of the Department of Bioinformatics in Infectious Diseases at the National Institute of Public Health in Mexico.
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