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title: 'Metagenómica funcional 2025. Tema 3'
disqus: hackmd
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Metagenómica Funcional 2025
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Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C. La Paz, Baja California Sur.
Noviembre 2025

**Dra. E. Ernestina Godoy Lozano** | [e-mail] | [e-mail]
## Tabla de Contenido

[TOC]

# Tema 3. Reconstrucción del perfil taxonómico
## 3.1. Preparación de espacio de trabajo

Feature: Generar directorio de trabajo
cd curso_2025
mkdir assembly

## 3.2. Reconstruccion de metagenoma

Feature: activar ambiente conda
source /opt/anaconda3/bin/activate
conda activate metawrap-env

Feature: Generar ligas simbolicas de archivos limpios
cd assembly
ln -s ../quality_control/READ_QC/mock_reads/*.fastq .

Feature: Generar ensamble
# Opcion1: Continuar con pipeline de metawrap
# Usando metaspades
#nohup metawrap assembly -1 final_pure_reads_1.fastq \
#-2 final_pure_reads_2.fastq -m 200 -t 4 \
#--metaspades -o ASSEMBLY &

# Usando megahit (~37 min)
#nohup metawrap assembly -1 final_pure_reads_1.fastq \
#-2 final_pure_reads_2.fastq -m 200 -t 4 \
#--megahit -o ASSEMBLY-M &

# Opcion2: megahit (~37 min)
#nohup megahit -1 final_pure_reads_1.fastq -2 final_pure_reads_2.fastq \
#-t 4 -o megahit_out &

Feature: Copiar ensamble del usuario egodoy
cd ASSEMBLY
cp -r /home/egodoy/curso_2025/assembly/ASSEMBLY/final_assembly.fasta .

cp -r /home/egodoy/curso_2025/assembly/ASSEMBLY/final_assembly.fasta .

## 3.3. Anotacion taxonomica de secuencias crudas y de ensamble metagenomico

Feature: Generar espacio de trabajo
cd ../taxonomy
mkdir KRAKEN && cd KRAKEN

Feature: Kraken2 con Secuencias crudas
# Generar ligas simbolicas de archivos crudos
#ln -s ../../quality_control/READ_QC/mock_reads/*.fastq .

#nohup kraken2 --db /Datos/DrRick/databases/kraken2/kraken2_plusPF \
#--threads 4 --report reads.report --use-mpa-style \
#--paired final_pure_reads_1.fastq final_pure_reads_2.fastq &

Feature: Kraken2 con ensamble
# Generar liga simbólica de ensamble
#ln -s ../../assembly/ASSEMBLY/final_assembly.fasta

#nohup kraken2 --db /Datos/DrRick/databases/kraken2/kraken2_plusPF \
#--threads 4 --report contigs.report --use-mpa-style \
#final_assembly.fasta &

Feature: Copiar resultados de Kraken2 
cp -r /Datos/curso_metagenomica/curso_2025/taxonomy/KRAKEN/contigs.report .

cp -r /Datos/curso_metagenomica/curso_2025/taxonomy/KRAKEN/reads.report .

Feature: Formateando las salidas para KronaTools
cat reads.report | awk -F"\t" '{ print $2 "\t" $1}' | sed 's/[dk]__//;s/|[pcofgs]__/\t/g' > kt_reads.report

cat contigs.report | awk -F"\t" '{ print $2 "\t" $1}' | sed 's/[dk]__//;s/|[pcofgs]__/\t/g' > kt_contigs.report

Feature: Generando Kronas
# Asegurate de estar en el ambiente conda metawrap-env
ktImportText -o mock_krona.html kt_contigs.report,mock_contigs kt_reads.report,mock_reads

Feature: Bajar krona a mi computadora scp -r ebioinfoXX@200.23.162.231:/home/ebioinfoXX/curso_2025/taxonomy/KRAKEN/*.html .

Feature: Metaphlan4
# Activar ambiente conda
conda activate metaplhan4
cd ..

mkdir METAPHLAN4 && cd METAPHLAN4
ln -s ../../quality_control/READ_QC/mock_reads/*.fastq .
#nohup metaphlan final_pure_reads_1.fastq,final_pure_reads_2.fastq \
#  --input_type fastq \
#  --nproc 4 \
#  --db_dir /Datos/DrRick/databases/metaplhan4 \
#  -x mpa_vJan25_CHOCOPhlAnSGB_202503 \
#  --mapout metagenome.bowtie2.bz2 \
#  -t rel_ab_w_read_stats \
#  -o profiled_metagenome.txt &
 
Feature: Copiar resultados de Metaphlan4

cp -r /Datos/curso_metagenomica/curso_2025/taxonomy/METAPHLAN4/* .

Feature: Concatenar en una sola matriz todos los resultados de metaphlan4
# Esto es necesario realizarlo cuando tenemos más de una muestra
# Pasos: 
# 1. Crear directorio y entrar al directorio
# 2. Crear ligas simbolicas de los profiled_metagenome
# 3. Aplicar script
#         merge_metaphlan_tables.py *.txt > merged_abundance_table_metaphlan2.txt

## 3.4. Matrices de abundancia

Feature: Generar directorio de trabajo
mkdir MATRIZ_ABUND && cd MATRIZ_ABUND
mkdir data figures

Feature:  Generar liga simbolica de matriz de abundancia y metadata

# Matriz de abundancias absolutas
cd data
ln -s /Datos/curso_metagenomica/matriz_abund/metaphlan_onlyBacteria.txt .
head metaphlan_onlyBacteria.txt
# metadata
ln -s /Datos/curso_metagenomica/matriz_abund/metadata.tsv
cat metadata.tsv

### 3.4.1 Generar niveles taxonomicos

Feature:  Generar niveles taxonomicos
/Datos/curso_metagenomica/scripts/taxa_levels_metaphlan.sh metaphlan_onlyBacteria.txt

Feature: Explorar directorio taxa_levels
ls taxa_levels

Feature: Continuar con practica en R
# Preparar el Rproject
cd ..
# Aseguremos que estamos en el directorio MATRIZ_ABUND
pwd
cp -r /Datos/curso_metagenomica/taxonomy_diversity .

### 3.4.2 Conexión a Rserver

Feature: Paso 1. Abrir otra terminal
ssh -L 8787:localhost:8787 ebioinfoXX@200.23.162.231

Colocar ***usuario*** y ***contraseña*** del servidor

Feature: Paso 2. Abrir un navegador de internet
http://200.23.162.231:8787/

Colocar ***usuario*** y ***contraseña*** del servidor


Te aparecera el Rserver si entraste de manera correcta


### 3.4.3 Normalizacion por abundancias relativas

Feature: Normalización de la Matriz completa
# Opción 2. Hacerlo con el Rscript
Rscript /Datos/curso_metagenomica/scripts/abund_relativa_args.R data/metaphlan_onlyBacteria.txt data/percent_integrated_matrix.txt
less -S data/percent_integrated_matrix.txt

### 3.4.4 Abundancia relativa de niveles taxonomicos:

Feature: Escoger un nivel taxonómico
# Opción 2. Hacerlo con el Rscript
# genero
Rscript /Datos/curso_metagenomica/scripts/abund_relativa_args.R taxa_levels/6.genus.txt taxa_levels/percent_Genus.txt
less -S taxa_levels/percent_Genus.txt

# clase
Rscript /Datos/curso_metagenomica/scripts/abund_relativa_args.R taxa_levels/3.class.txt taxa_levels/percent_Class.txt
less -S taxa_levels/percent_Class.txt

### 3.4.5 Generacion de barras apiladas con corte de abundancia

Feature: Corte de abundancia del 1%
# Opción 2. Hacerlo con el Rscript
Rscript /Datos/curso_metagenomica/scripts/sock_plots_corte.R taxa_levels/percent_Class.txt percent_Class_more_1_perc.txt 1

## 3.6. Alfa y Beta diversidad

Feature: La matriz de abundanncia tiene que ser abundancia absoluta
# Opción1. Hacerlo con el Rscript
Rscript /Datos/curso_metagenomica/scripts/alpha_beta_diversity_args.R metadata.tsv taxa_levels/6.genus.txt Type

Feature: Indices de alfa diversidad
cat alpha_diversity_index.txt

Feature: Ordenar las graficas
mv *.png ../figures

Feature: Bajar graficas a mi computadora
scp -r ebioinfoXX@200.23.162.231:/home/ebioinfoXX/curso_2025/taxonomy/MATRIZ_ABUND/figures .

## Enlaces
:::info
**Etherpad** Deja tu pregunta
https://etherpad.wikimedia.org/p/metagenomica_funcional_2025

**MetaPhlan4**
https://github.com/biobakery/MetaPhlAn/wiki/MetaPhlAn-4.1

**Kraken2**
https://benlangmead.github.io/aws-indexes/k2
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