一級分析/定序儀 === ###### tags: `基因體/一級分析` ###### tags: `生物資訊`, `基因體`, `一級分析`, `定序儀`, `NGS`, `第三代`, `第四代` <br> [TOC] <br> ## [一/二/三級分析示意圖](https://www.dellemc.com/en-in/collaterals/unauth/white-papers/solutions/parabricks-isilon-nvidia-wp.pdf) ![](https://i.imgur.com/daU0kSo.png) <br> ## 預備知識 ### PCR 原理 > PCR: Polymerase Chain Reaction 聚合酶連鎖反應 - [10502選修生物ch11 5 06基因放大技術 聚合酶連鎖反應PCR二簡](https://www.youtube.com/watch?v=vUxyiAYOh5w) - [螢光定量PCR原理簡介](https://yourgene.pixnet.net/blog/post/119714034) <br> ## 第一代：桑格定序 - ### 介紹 - [簡介一代定序---Sanger定序@ 基因叔叔](https://unclegene6666.pixnet.net/blog/post/305966068) - ### 方法：[雙去氧鏈終止法 (dideoxy chain-termination method)](https://yourgene.pixnet.net/blog/post/66237085) - 又稱：桑格法 (Sanger method), 桑格定序 (Sanger Sequencing) - 影片：[註1](https://www.bilibili.com/video/av45259672/?spm_id_from=333.788.videocard.0) ![](https://pic.pimg.tw/unclegene6666/1490858845-378671506_n.png)([圖片來源](https://unclegene6666.pixnet.net/blog/post/305966068)) #ddNTPs ddATP ddCTP ddTTP ddGTP ![](https://pic.pimg.tw/yourgene/1309618661-09251ce40cf54bf11188879bbeffd8e0.png)([圖片來源](https://yourgene.pixnet.net/blog/post/66237085)) ![](https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/3d/Radioactive_Fluorescent_Seq.jpg/330px-Radioactive_Fluorescent_Seq.jpg) - ### 問題 - 怎麼知道 DNA 片段位在那條染色體上？ - i.e. DNA 片段，如何分類到那條染體？ - 怎麼判斷 DNA 片段是「正股」或「反股」？ - DNA 是互補的兩股，怎麼知道是定序到那一股？ - 正股/反股, [編碼股/模板股（又稱非編碼股）](https://smallcollation.blogspot.com/2013/08/transcription.html#gsc.tab=0), coding strand/template strand - [[討論] 基因在DNA的哪一股??](https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1221739572.A.F36.html) - [轉錄(transcription)](https://smallcollation.blogspot.com/2013/08/transcription.html#gsc.tab=0) <br> ## 第二代：次世代定序 > 次世代定序 (Next Generation Sequencing, NGS) - ### [簡介次世代定序--- Next Generation Sequencing (NGS) @ 基因叔叔](https://unclegene6666.pixnet.net/blog/post/311357839) - ### [推動基因檢測技術發展的兩大巨頭—illumina和羅氏](https://kknews.cc/finance/2qm66rg.html) - ### [基因组的那些事儿--基础](https://www.jianshu.com/p/bf871522ea20) ### HiSeq X系列——HiSeq X Five，HiSeq X Ten > HiSeq X Ten系統的問世完成了人類歷史上一大里程碑事件——千元基因組時代的到來。 HiSeq X Ten系統是由一套共10台超高通量的HiSeq X儀器組成，其中每台儀器可在3天內產生高達1.8 Tb測序數據，即每天高達600 Gb。 10台聯合工作，每年能帶來超過18,000個人類基因組，而每個基因組的價格約為1000美元，讓癌症和復雜疾病的研究達到新的水平 ### 至於NovaSeq嘛， > 應該是17年開始交付使用，被稱為“史上最貴洗衣機”的NovaSeq6000，以其酷炫的外形和美麗的價格（100w美金）成為了高端測序領導者，旨在衝刺“100美元基因組測序”。它的通量更高，運行週期48小時，2個flowcell每次產生大於2Tb的數據。另外還有它兄弟Novaseq 5000，差異就是他們的流動槽，5000可以運行S1、S2兩種，6000可以運行S1、S2、S3、S4四種，一個S4流動槽每次運行可達到80-100億數量的reads / clusters。雙S4流動槽運行可以不到兩天內解碼48個人類基因組（6萬億鹼基通量），比雙S2流動槽通量翻三倍 - ### [對第一代，進行平行化處理](https://hilelojack.pixnet.net/blog/post/99442019) - ### [第二代晚期，直接判讀「H離子」的釋出，省去螢光試劑成本](https://hilelojack.pixnet.net/blog/post/99442019) <br> ## 第三代：單分子即時定序 > 單分子即時定序 (Single Molecule Real Time sequencing, SMRT) - ### 問題 - 對第二代進行改善，不使用 PCR (?) - 參考序列不完整的，中間有許多空洞需要填補與更新 - 基因體內有重複及缺失的片段，第二代無法處理 - 超過 80% 變異，無法透過第二代找到 ← 第二代在做白工？ - ### [三代定序再度掀起革命：從頭定序（de novo sequencing）](https://investigator.tw/7061/%E4%B8%89%E4%BB%A3%E5%AE%9A%E5%BA%8F%E5%86%8D%E5%BA%A6%E6%8E%80%E8%B5%B7%E9%9D%A9%E5%91%BD%EF%BC%9A%E5%BE%9E%E9%A0%AD%E5%AE%9A%E5%BA%8F%EF%BC%88de-novo-sequencing%EF%BC%89/) - 定序長度：3,000 到 15,000 鹼基對 (bp)，最長可達 60 kb - ### [長江後浪推前浪，第三代定序技術亮眼突圍](https://geneonline.news/index.php/2019/02/21/breakthrough-of-third-generation-sequencing/) - ### [分類-計算生物學](https://investigator.tw/category/science-report/bioinformatics/computational-biology/) - [第三代定序 — SMRT 技術及原理](https://investigator.tw/7007/) - ### [第三代定序於臨床醫學上的應用](https://investigator.tw/7142/第三代定序於臨床醫學上的應用/) ![](https://i.imgur.com/JFbP3V3.png) - ### [走過半世紀的基因定序 從研究技術蛻變成為產業支柱 (下)](https://geneonline.news/index.php/2019/07/16/half-a-century-of-gene-sequencing-from-research-technology-to-pillars-of-industry-2/) - ### [圖爾思導入 PacBio、Nanopore 定序平台！瞄準三代定序市場 | GeneOnline News](https://geneonline.news/biotools-genome-sequencing/) - 優勢 - 解析度 如表皮葡萄球菌與金黃色葡萄球菌在解析度不好的狀況下難以分辨，這容易使醫生做出錯誤判斷，無法對症下藥。 - 完整度 二代定序可能出現片段缺失、結構變異，三代則能有效避免。 - 資料庫完整度 人類在微生物基因定序上的研究還太少，且有許多片段是二代定序無法比對，微生物對人類健康、疾病影響重大，三代的出現將能有效組建微生物基因資料庫。 <br> ### PacBio HiFi 定序 - ### [【三代定序 新知分享】我全都要!! PacBio HiFi reads讓你好貪心也沒關係](https://www.toolsbiotech.com/news_detail.php?id=39) ![](https://i.imgur.com/tEoXFkf.png) - ### [PacBio第三代测序技术迎来创新性升级，准确度可与二代测序相媲美 | Nature Biotech...](http://www.360doc.com/content/19/0814/19/52645714_854863434.shtml) ![](https://i.imgur.com/LQVohee.png) > 研究团队发现，新CCS测序方法检测微小变异和结构变异的能力与短读长测序相当，甚至超过了短读长测序。几乎所有（99.64％）变体都可以被分类为单倍型，从而进一步改善变异检测。值得关注的是，单独使用CCS的reads进行从头基因组组装可以产生连续且准确的基因组，其contig N50超过15Mb，一致性为99.997％，基本优于已有长读长测序方法。同时，据研究人员估计，利用该测序方法可以纠正GIAB参考序列中的2,434个基因测序错误。此外，新方法有助于产生更加完整的基因组，以及分析所有基因区域的序列，包括短读长技术的低映射区域，且成本与当前的短读长测序相似。 > > ### 是否还需要“polishing”？ > polishing通常指将PacBio的长reads与Illumina的短reads相结合，将短reads覆盖在长reads上以对其进行polishing，或矫正错误位点。对此，Wenger博士做出了回应：“PacBio的新测序方法不需要polishing。这些reads的原始平均准确度为99.8％，与短reads的准确度相似。” > > 作为二代测序技术的强劲对手，第三代测序技术在近期所取得的一系列突破性进展，必将再次推动其在生命科学研究以及精准医学等领域的普及应用！ <br> ## 第四代 - ### [精準醫學技術篇——大幅提高第四代測序準確率的INC-Seq](https://kknews.cc/science/4ljjqg.html) <br> ## 定序費用 - ### [長庚大學-分子醫學研究中心-基因體定序技術平台](https://cgmmrc.cgu.edu.tw/p/412-1029-9965.php?Lang=zh-tw) - ### [成大醫院-生物資訊分析收費標準](http://cgm.ncku.edu.tw/page04.asp) <br> ## 定序種類 - ### [目標區間定序(Targeted Sequencing)](http://www.yourgene.com.tw/content/messagess/contents/655574056304212354/) - ### [全基因體定序 (whole genome sequencing, WGS) 與全外顯子定序 (whole exome sequencing, WES) 該選哪種呢？](http://toolsbiotech.blog.fc2.com/?no=122) - ### [全基因組分析能讓我們知道多少事？](https://pansci.asia/archives/141209) <br> ## 定序服務廠商 - ### [明欣生物科技有限公司](http://www.missionbio.com.tw/files/Product/MB_DNA_Sequencing_Requirements.pdf) - 未知濃度者，因需測 OD， - OD: Optical Density 光密度 - [[生化]什麼是OD值?](https://tw.answers.yahoo.com/question/index?qid=20050928000013KK04942) - Answer1 - DNA會吸收260nm的光,然後送進光譜儀可得一圖形 - Answer2 - OD值是指一物質在某特定波長及固定距離下對於該光源的吸收值或是說該光源可穿透的程度，且OD值並無特定單位，現在一般是用於測量濃度 - 假設某一化學物質可吸收某一波長的光 ，則該化學物質在溶液中的濃度，會與溶液對該波長的吸光值(absorbance)成一正比關係，因此利用分光光度儀(spectrophotometer) 測定吸光值後，即可推知該化學物質在溶液中的濃度。 - ### [基龍米克斯生物科技](https://ls.genomics.com.tw/order_Rev/upload_files/Q4.pdf) [![](https://i.imgur.com/pesKvuE.png)](https://i.imgur.com/pesKvuE.png)