# 113-2 生物學（二）期末
## Lek.9 Intracellular compartments and transport
> 蔣輯武PhD
### 胞內運輸
細胞內、各胞器間的蛋白質運輸可以分成：**transport through nuclear pore**（1）、**transport across membrane**(2)、**vesicular transport**(3)
(1)是用在細胞質到細胞核
(2)是細胞質到粒線體、過氧化體
(3)是內膜系統
#### Signal Sequence
通常約15~60個胺基酸長，可以引導蛋白到正確的位置。運輸完成後，會被切除。
#### 囊泡運輸(3)
囊泡可以運輸蛋白與脂質於golgi和ER之間。可依方向分為exocytosis胞泌（secretory）和endocytosis內吞（endocytic）
##### 囊泡的protein coat
蛋白質外套膜可以幫助把膜型塑成囊泡並捕捉特定分子。
###### Clathrin-coated vesicle
- cargo receptor插在膜上，辨識出cargo
- Clathrin coat protein組裝在囊泡膜上
- Adaptin穩固Clathrin coat並與cargo receptor結合
- Dynamin是GTPase，夾住囊泡跟膜連接的部分
- 囊泡形成後，coat解開
- 途徑：
- 從golgi apparatus經endosome送到lysosome
- 細胞膜送到endosome（內吞作用）
##### 囊泡如何運輸到終點
Rab(GTPase)會和囊泡結合，tethering protein/rab effectors位於目標膜上，會辨識到rab。目標膜上的t-snare和囊泡上的v-snare會進一步把囊泡拉近目標膜。
##### 胞泌作用
分為constitutive和regulated。前者所有細胞都有，後者要經過荷爾蒙或神經傳導物質刺激才會發生，且通常只在特定分泌細胞有。
##### 內吞作用
可以攝入養分、液體，或是清除細胞碎片、入侵的微生物。分為胞飲pinocytosis和吞噬phagocytosis。前者主要是運輸直徑100nm以下囊泡，正常細胞也藉此攝入細胞膜；後者通常是直徑大於250nm的囊泡，特殊細胞稱為professional phagocyte(e.g. macrophages巨噬細胞, dendritic cells樹突細胞)才能進行。
**Receptor-mediated endocytosis**用於攝入並減少一些特定的大分子（e.g.LDL），或是攝入營養、濃縮分子、提供必要分子
LDL受體異常時，會造成LDL很難被代謝，形成心血管疾病（atherosclerosis動脈硬化）。
### Double-Layered
#### Nucleus
- Formed through invagination（內凹） of plasma membrane
- 外膜與ER相連
- 有lamina支持其形狀
- 核孔有nuclear pore protein complexes
##### Nuclear Pore Complex(NPC)
由約30個蛋白組成，是柔軟、膠狀、交纏的網絡。其外側有cytosolic fibrils, 內部有nuclear basket, column structure, meshwork。
NPC可以進行主動（>60kDa）與被動運輸（<60kDa）。主動運輸時，是細胞質中的nuclear import receptor和蛋白上的nuclear localization signal(NLS)結合後進入。
##### Ran-GTP
是Ran-GTPase和GTP結合的狀態，在細胞核中較多，可以幫助蛋白質進入核。而Ran-GTP上的GTP水解後，會成為Ran-GDP，屬於不活化狀態，細胞質中多。
#### Mitochondria
- Endosymbosis（內共生）
- Got three layers at first, but the one from the host disappeared（本來是葛蘭氏陰性好氧原核生物alphaproteobacteria，有兩層膜。加上宿主的共三層。後來宿主的不見了。）
- Five Compartments:
- outer membrane
- inner membrane
- cristae
- intermembrane space
- matrix
- 環狀DNA
- 有2~10 copies, 16kb
- 母系遺傳
- 利用氧化磷酸化（phosphorylation）產生ATP
- 大部分粒線體蛋白（約2000個）需要從細胞質送到內膜上（皺折）
- **細胞中數量最多**（扣除Ribosome）
##### 蛋白質運輸進入粒線體
**未折疊**的蛋白質前驅物上的MTS(mitochondria targeting sequence)會和translocators結合（粒線體外膜一個、內膜一個）。translocators把蛋白質前驅物送入基質matrix後會被折疊，signal peptidase會切下MTS。
### Single-Layered
#### Peroxisome
- 主要功能是**氧化解毒ROS**（reactive oxygen species活性氧類）和**代謝脂肪酸**
- 合成myelin sheath的phospholipid
- 在肝臟、腎臟中代謝毒物、酒精、脂肪酸
- 催化H~2~O~2~的製造與分解
##### 蛋白質運輸進入過氧化體
運輸進入過氧化體的蛋白有PTS(peroxisomal targeting signal)，位於C-terminus
其缺陷可能造成**Zellweger syndrome**，腦部、肝腎異常。患有此病的新生兒預期壽命不超過一年。
#### ER(Endoplasmic reticulum)
- 由interconnecting tubules(細管) and sacs(囊)包住ER Lumen
- Rough ER: 有membrane-bound ribosome在表面上
- 蛋白質與脂質合成的重要場所
- 儲存Ca^2+^（次要儲存場所是粒線體）
- **細胞中面積最大**
##### ER and translation
核糖體進行translate時，ER signal sequence（在N terminus）會和SRP(signal recognition particle)結合，把核糖體帶到ER表面上。Translocator會把**未折疊**的蛋白插入ER，形成loop。其中需要GTP與GTP水解。
##### ER中的蛋白修飾
1. Disulfide bond formation
2. N-linked glycosylation：Oligosaccharyl transferase(在膜上，活性部位面向ER內)會在Asparagine(Asn)上面接上Oligosaccharide
#### Golgi apparatus
- Golgi的結構分為：（面向ER）cis-golgi network CGN, cisterna(分為cis, medial, trans cisterna), trans-golgi network TGN（背向ER）
- 有修飾蛋白寡醣鏈的功能
- 碳水化合物的磷酸化
- **O-glycosylation at Ser/Thr**
- 其他修飾：sulfation of tyrosines and carbohydrates
#### Endosome & Lysosome
內吞作用的囊泡會形成early endosome，和golgi分泌的囊泡結合後形成late endosome，出現在細胞核附近。endosome上有H^+^幫浦，可使其變酸（pH 5~6）。
late endosomes發展成lysosome，有40種酸性水解酶，包括nucleases, proteases, lipases等。這些酶是用囊泡從ER傳遞到TGN的。mannose-6-phosphate group是在CGN修飾的。

## Lek.10+11 Cell Communication
> 陳威宇PhD

細胞傳訊的方式非常多，例如：
#### 內分泌（endocrine）
有些荷爾蒙是需要和細胞**內**的受器結合，調節轉錄（nuclear receptor superfamily）。通常，與胞內受器結合後的荷爾蒙可以進入細胞核，扮演正向調控轉錄的功能（具有DNA binding domain）。但是，也有負向調控的。
:::success
##### GLP1與胰島
以下分別說明GLP-1在胰島內三種主要細胞──β、α、δ細胞中的作用機制，以及它如何改善胰島素阻抗。

1. GLP-1受體分佈
• β細胞：高密度表達GLP-1R，是主要作用靶點。
• α細胞：中度表達，可直接抑制胰高血糖素（glucagon）分泌。
• δ細胞：也有GLP-1R，能促進生長抑素（somatostatin）釋放，形成局部旁分泌調控。

2. 對β細胞的作用
• GLP-1結合Gᵢ/Gₛ偶聯之GLP-1R，誘發cAMP上升，進而啟動PKA和Epac2路徑，加強葡萄糖依賴性胰島素分泌，同時提升胰島素基因轉錄、促進胰島β細胞增生及抑制凋亡。

3. 對α細胞的作用
• GLP-1直接在α細胞中降低cAMP，抑制葡萄糖濃度升高時的glucagon分泌；另者β→δ→α的旁分泌環路（見下）也進一步加強抑制。

4. 對δ細胞的作用
• GLP-1刺激δ細胞釋放somatostatin，somatostatin反過來以旁分泌方式抑制α細胞glucagon與β細胞胰島素的過度波動，穩定血糖。

5. 如何改善胰島素阻抗
(1) 降低glucagon：減少肝醣新生與肝臟葡萄糖釋放，改善肝臟對胰島素的敏感性。
(2) 體重下降：透過抑制胃排空、增加中樞飢餓閾值，減少能量攝取和脂肪堆積，緩解脂肪組織發炎與脂毒性，提升周邊組織（肌肉、脂肪）胰島素訊號傳導。
(3) 抗發炎與心血管保護：GLP-1R激活能降低全身低度慢性發炎，並改善血管內皮功能，也有助對抗與胰島素阻抗相關的心血管風險。
(4) 直接作用周邊組織：研究顯示GLP-1R在骨骼肌、心臟、腎臟等也有表達，可促進葡萄糖攝取、增強胰島素訊號，進一步降低阻抗。

總結︰GLP-1透過多重路徑──強化β細胞功能、抑制α細胞過度分泌、δ細胞旁分泌調控，以及中樞與周邊代謝效應──不僅改善胰島素分泌不足，也緩解各組織的胰島素阻抗，因而在第2型糖尿病治療中具備綜合性優勢。
By Copilot
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#### 旁泌（paracrine, 訊息分子傳給附近的細胞）
旁泌常使用的local mediator包括NO, histamine, nerve growth factor, platelet-derived growth factor, epidermal growth factor(癌症的此receptor常變異)。
舉NO為例，內皮細胞（endothelial）接收到acetylcholine刺激後，會活化NOS(NO synthase)。精胺酸（arginine）會被NOS轉為NO。NO快速擴散通過細胞膜後，與平滑肌細胞的guanylyl cyclase結合，使GTP被轉為Cyclase GMP，造成平滑肌舒張。Viagra透過抑制PDE5，防止cGMP分解為5'-GMP，維持平滑肌舒張。
#### synaptic（神經突觸）
常見的神經傳導物質，如acetylcholine, $\gamma$-AminoButyric Acid(GABA)等。同樣的傳導物質在不同細胞上可能作用不同。
#### contact-dependent（直接接觸）
例如，一個細胞分化後，可以透過contact-dependent的方法讓周圍的幾個細胞不會分化成同樣的細胞（e.g.分化成神經的上皮細胞透過Delta阻止其他上皮細胞分化）。
Delta的受體Notch很有趣，本身就是轉錄因子。Notch被Delta刺激後會斷裂，尾端（細胞內側）進入細胞核，影響轉錄。
Juxtacrine是用膜上的蛋白放到別人的receptor上，例如前述Delta-Notch；Gap junction則是直接用膜蛋白連結兩個細胞。
### 細胞表面的receptor
這種receptor可分為三種類型
#### ION-Channel-Coupled Receptors（簡稱ICCR）
##### 概述
signal molecule結合到ion channel上，使其打開，讓ion流入細胞。
#### G-Protein Coupled Receptors*（簡稱GPCR）
##### 概述
signal molecular和receptor結合後，receptor活化胞內的G protein，活化的G protein再活化目標酶。
##### 過程
G-protein由$\alpha,\beta,\gamma$三個次單元構成。在不活化的狀態時，$\alpha$次單元夾了一個GDP，和另外兩個次單元組合在一起。GPCR被刺激後，刺激GDP從G protein上離開，GTP加入。接下來，$\alpha$夾著GTP，和另外兩個次單元分離（另兩個次單元仍組合在一起），都被活化，發揮功能。接下來，$\alpha$和目標蛋白結合，活化目標蛋白。$\alpha$再自己把GTP水解，釋出pi後恢復不活化狀態，和另外兩個次單元組合回去（此時目標蛋白也跟著不活化）。
在心肌細胞中，活化的$\beta,\gamma$會打開K^+^ channel使K^+^流出。
##### 功能
G protein可能直接調控離子通道，也可能活化膜蛋白製造小分子訊號、進行訊號放大。例如，G protein $\alpha$ subunit活化後可以和adenylyl cyclase（膜蛋白）結合並活化之，將ATP轉換為cyclic AMP。cAMP phosphodiesterase再將之轉換為AMP。
此外，GPCR也可調控Phospholipase C。
###### cAMP調控的生理反應
| 胞外訊號分子|目標組織 |主要反應|
| -------- | -------- | -------- |
|Adrenaline腎上腺素|heart|增加心率與收縮力|
|Adrenaline|skeletal muscle|glycogen肝醣 breakdown |
|Adrenaline, Glucagon|fat|fat breakdown|
|Adrenocorticotropic Hormone, ACTH促腎上腺皮質素|adrenal gland|cortisol皮質醇 secretion|

\*有一些local mediators和neurotransmitter也是cAMP調控
###### 案例：cAMP如何調控肝醣降解
Adrenaline活化GPCR，活化G protein $\alpha$ subunit，活化adenylyl cyclase，製造cAMP。cAMP活化PKA，把一個ATP上的pi拿來和phosphorylase kinase結合，活化之。kinase再透過把ATP上的pi拔給glycogon phosphorylase以活化之，造成glycogon breakdown。
\* kinase的功能是加磷酸根（從ATP之類的地方拔來加到別的分子）
###### 案例：cAMP活化基因轉錄
Adrenaline活化GPCR，活化G protein $\alpha$ subunit，活化adenylyl cyclase，製造cAMP。cAMP活化PKA，PKA進入核膜，活化transcription regulator後活化特定基因的轉錄。
###### Phospholipase C(PLC)調控的生理反應
| 胞外訊號分子|目標組織 |主要反應|
| -------- | -------- | -------- |
| Vesopressin|liver| glycogen breakdown|
| ACh | pancrea |secretion of amylase澱粉酶|
| ACh | smooth muscle | contraction|
| Thrombin | blood platelets| aggregation聚合 |
###### PLC訊號途徑
PLC的主要功能是使ER儲存的Ca^2+^釋放。
Adrenaline活化GPCR，活化G protein $\beta,\gamma$ subunit活化膜上的PLC，使膜上的inositol phospholipid分解出inositol 1,4,5-trisphosphate(IP~3~)和diaclyglycerol（膜上）。IP~3~使ER上的鈣離子通道打開，釋出鈣離子。鈣離子活化PKC，接上diacylclycerol。
鈣離子可以活化calmodulin protein，改變其構型。
:::success
##### Flourescence Resonanace Energy Transfer, FRET
是一種可以用來觀測蛋白質間距離的技術。
:::
#### Enzyme-Coupled Receptors（簡稱ECR）
##### 概述
一個molecule in form of a dimer和一對inactive catalytic結合，使其activate。或者，一個分子使一對receptor活化，進一步活化其他酶。
##### RTK:Receptor Tyrosine Kinases, 受體酪氨酸激酶
RTK是最常見的ECR，主要活化GTPase Ras。RTK被dimer狀訊息分子活化後，與很多pi結合（磷酸化位點很多），胞內部分接上很多訊號蛋白。
例如，可以接上Grb2（adaptor protein），Grb2接上SOS（Ras-GEF），將原本裝有GDP的不活化Ras蛋白（用共價鍵與膜上脂質連接）的GDP換成GTP，活化之。Ras可以觸發一系列訊息傳遞，調控蛋白質活動或基因表現。

活化的RTK也可以接上PI 3-kinases，把膜上的PIP2（inositol phospholipid）磷酸化為PIP3，PIP3可以再接上別的protein kinase，把Akt（接在另一個PIP3上）活化後觸發後續訊息傳遞。Akt的一個功能是接收細胞存活訊息，透過磷酸化Bad抑制之，使Bcl2不會被抑制，進而避免細胞凋亡。Akt的另一個功能是活化Tor，促進細胞生長。
##### Ethylene signaling pathway
沒有Ethlyene時，active ethlyene receptor(ER上)上的protein kinase會裂解轉錄因子，讓部分轉錄無法發生；有ethlyene時，ethlyene receptor被抑制，造成protein kinase被抑制，轉錄因子不被破壞，可以使部分轉錄發生。

#### 影響cell-surface receptors的物質
| 物質| 正常訊號 | 對receptor的影響 |效果 |
| -------- | -------- | -------- | -------- |
|BZD, Barbiturates|GABA|刺激原本由GABA刺激的ICCR|鎮靜、緩解焦慮|
|Nicotine|Acetylcholine|刺激ACh活化的ICCR|血管收縮、提高血壓|
|Morphine, Heroin|endorphin, enkephalin|刺激GPCR(opiate)|鎮痛、欣快感|
|Curare箭毒|ACh|**阻斷**ACh活化ICCR|麻痹（paralysis）|
|Strichnine番木鱉鹼|Glycine甘氨酸|**阻斷**甘氨酸活化ICCR|影響中樞神經，造成癲癇/痙攣|
|Capsaicin辣椒素|heat|刺激溫度敏感ICCR|導致熱痛，長時間暴露卻可鎮痛|
|Menthol|Cold|刺激溫度敏感ICCR|適當劑量可有涼感，過度劑量導致灼痛|
### 細胞內的訊息傳遞
很多細胞內的訊息傳遞蛋白（intracellular signaling protein）透過與ATP、GTP分子互動進行訊息傳遞。例如：蛋白經protein kinase接收ATP轉為ADP時釋出的pi活化，再由phosphatase將pi移除，回到不活化狀態；或是**蛋白在不活化時與GDP結合，GDP被GEF置換為GTP後蛋白活化，GTP被hydrolysis(GAP)水解為GDP後，蛋白就變回不活化狀態。**

## Lek.12 Cytoskeleton
> 蔣輯武PhD
### Introduction: Actin Filament, Intermediate Filament, Microtubule
細胞骨架是由蛋白質組成，存在**真核**細胞中。功能包括維持細胞形狀、機械支持、幫助組織內部胞器位置、協助細胞移動等等。

| Intermediate Filament | Microtubule | Actin Filament |
| -------- | -------- | -------- |
| 10nm(直徑) | 25nm | 7nm |

### Actin Filament
微絲（肌動蛋白絲, F actin）起源自**cortex**，決定細胞的形狀與運動。可以**使肌肉與非肌肉細胞收縮**。
#### 組成與結構
F-actin由球狀單體G-actin組成（**非共價鍵**）。其結構為螺旋形，直徑7nm，每37nm轉一圈。具有**極性**，分為Plus/Minus End兩端。
帶有**ATP**的actin很容易接到Plus end；ATP水解後，帶著**ADP**的actin則容易從Minus end脫離。若單體濃度高，就會從plus端變長；若單體濃度低，從minus端變短；若濃度適中，則會同時增長變短，長度維持動態平衡，稱為**treadmilling**
#### 影響actin filament的（毒性）物質
| 物質| 機轉| 來源|
| -------- | -------- | -------- |
|Phalloidin|與filament結合，使其穩定長度不變|death cap mushroom|
| Cytochalasin|與plus end結合使其無法增長| fungi |
|Latrunculin| 和G-actin結合使其無法聚合| sponge |

#### 各種影響actin filament的物質
- 影響單體(G-actin)
- monomer-sequestering: 結合後抑制增長
- nucleating: 當成起始點（nucleus但不是細胞核）開始長出filament
- 影響鏈(Actin Filament)
- severing: 切斷
- cross-linking: 在cortex中連結f-actin，形成更高階的結構
- capping: 阻止增長或縮短（看結合在哪一端）
- side-binding: 和肌肉收縮有關，也有穩定功能
- **myosin motor**: 運送東西或成對出現使細胞收縮運動
- bundling: 把f-actin綁成一束，形成更高階的結構
#### 細胞的運動
細胞附著在substratum上，透過調控G-actin的濃度運動。首先，細胞前端會形成lamellipodium，有高濃度單體，使微絲變長。細胞的尾巴，會有較低濃度的單體，因此微絲分解。透過一端微絲增長一端微絲變短，細胞可以達成有方向性的移動。
- Filopodium
- 細胞移動時，位於最前端
- 以**bundling**構成
- 受**Cdc42**刺激產生
- Lamellipodium
- 在Filopodium後面
- 以**cross-linked**構成
- 受**Rac**刺激產生
- Stress fibers
- 在Lamellipodium後面
- 以**bundling**構成
- 為細胞收縮的單元
- 受**Rho**刺激產生
> Rho, Rac, CDC42都是GTPase，統稱Rho Family
#### Myosin
Myosin是一種molecular motor。它跟運送、細胞外型有關。
##### Myosin I
Myosin I有頭部（head domain, ATPase）和尾部（tail domain），**往plus end走**。在myosin家族中，頭部的變異較小，尾巴則視其功能會有差異。例如，尾巴可以連結其他蛋白、胞器或細胞膜。
##### Myosin II In Non-muscle Cells
Myosin II由2個light chains和2個heavy chains，共4個次單元組合。其頭部也是ATPase，並透過尾部纏繞。
在非肌肉細胞中，影響細胞移動、附著、分裂，也可產生收縮的力。其透過**兩兩腳對腳**的方式在兩個微絲間滑動。因為Myosin朝plus端滑動，所以造成微絲往（自己的）minus端滑動。
##### Myosin II In Muscle Cells
Myosin II在肌肉細胞中，是幾百個腳對腳綁在一起，構成thick filament（相對actin filament是thin）。
肌肉收縮的單元稱為sarcomeres（肌小節，長度約為2.2$\mu m$）。一個肌小節的**兩側**是F-actin（thin filament，顯微影像較白），中間是myosin II束（thick filament，顯微影像較黑）。
myosin II的頭部指向微絲的plus end。肌肉收縮時，myosin II往微絲的plus end爬。因此，收縮時**纖維長度不變**。而兩個肌小節間，是微絲plus end相互接觸的地方，稱為Z-disc。
##### Myosin Head的「滑動」的原理
1. myosin head和微絲連結，處於「僵直」（rigor）狀態
2. myosin head接上ATP，發生構型改變，離開微絲
3. ATP被水解為ADP+Pi，myosin head構型改變，往前5nm
4. myosin head和微絲（新位置）形成弱連結。釋出Pi，重新獲得強連結（power stroke）
5. 釋出ADP，回到1.

因此，myosin head「滑動」的本質，其實是和ATP互動後構型改變。每次構型改變都向前跑一點點。
##### 肌肉收縮的發動：Ca^2+^的釋放
肌纖維的細胞膜有凹陷，稱為transverse tubules(T tubules)；其內質網ER則特化為sarcoplasmic reticulum(SR)。在SR和T tubules中，都有大量的Ca^2+^（T tubules算是胞外環境）。
當動作電位傳到T-tubule上，其voltage-gated Ca^2+^ channel打開（朝向細胞質）。湧入細胞內的鈣離子會促使SR上的鈣離子通道也打開，放出大量鈣離子（到細胞質），造成肌肉收縮。
### Intermediate Filament
中間絲最主要的工作是維持細胞和細胞核的機械強度，直徑約10nm。同時可以在細胞質和細胞核中發現，是維持細胞核的結構nuclear lamina的重要成分。因此，中間絲有最強的機械強度，固定在desmosome上（細胞橋間體）。
#### 組成
構成中間絲的，是$\alpha$-helical structure。兩條螺旋蛋白同向交纏，形成coiled-coil **dimer**；兩條dimer**反向**交纏成**tetramer**，為中間絲的基本單位。因為是反向交纏而成，所以中間絲**沒有極性**。
#### 異常時造成的疾病
中間絲異常，可能造成：
- Epidermolysis bullosa simplex表皮溶解水皰症（butterfly children泡泡龍）
- Keratin基因突變導致basal layer(基皮層)破裂
- Muscular dystrophy肌萎縮
- Neurodegeneration神經退化
- Progeria早衰症
- 一種premature aging syndrome
- Lamin基因突變造成nuclear lamina異常
### Microtubule
一條微管由**13**條protofilament圍成，是**有極性的**中空管狀結構。protofilament由$\alpha,\beta$兩種tubulin構成。$\alpha$在minus端；$\beta$在plus端。
Tubulin在與GTP結合後，會更容易與plus端結合形成GTP-cap，然後水解GTP為GDP。與GDP結合的tubulin，結合穩定度不高，更容易崩解。此性質稱為dynamic instability。
微管的功能包括控制胞器位置、運送胞器和vesicle、構成鞭毛（flagella/flagellum）和纖毛（cilia/cilium）；此外，微管也在細胞分裂時構成紡錘絲（mitotic spindles）。
#### 發源
微管發源自MTOC（MicroTubule Organizing Center）。在動物細胞中，MTOC是**Centrosome中心體**。
在正常狀況下，一個細胞有一個中心體，在一個細胞循環中複製一次（所以分裂後的兩個細胞又各有一個中心體）。中心體由兩個centrioles（中心粒）和centrosome matrix（中心體基質）組成。基質中有許多**環狀結構$\gamma$-tubulin ring complex**，構成nucleation center，微管由此處開始延伸。nucleation center是minus端，微管由此射出，因此細胞質是plus端。
#### 影響微管的物質
| 物質 | 機轉| 備註 |
| -------- | -------- | -------- |
| Taxol | 結合並穩定微管| 化療藥|
| Colchicine, colcemid | 與tubulin dimer結合使其無法聚合 ||
| Vinblstine, vincristine |與tubulin dimer結合使其無法聚合 | |

Taxol(Paclitaxel,紫杉醇)是化療藥物。透過結合微管使其無法延長，可以使紡錘絲無法正常運作。因此，細胞無法分裂，造成mitotic arrest，最終導向死亡。由於Taxol針對紡錘絲，會影響所有快速分裂的細胞，因此除了卵巢、乳、肺、子宮內膜、頭頸、攝護腺、頸椎等癌症細胞外，也會影響其他正常但會分裂的細胞。
#### 微管上的molecular motor
微管上的motor有兩個ATPase球狀頭部和尾巴。**Kinesin**朝Plus端走，**Dynein**朝minus端走。
Kinesin協助拉開ER，Dynein協助把Golgi往中心體、細胞核的方向拉。
#### 鞭毛與纖毛
鞭毛與纖毛的結構非常相似，都由9+2條微管組成，稱為Axoneme。9條微管圍在周圍，中間有2條微管。微管間以dynein和cross-linking protein連接，使其可以移動。
##### Cilia
Cilia的功能是移動細胞表面的液體、使單細胞生物移動或是捕捉食物（protozoa原生動物）。在人體中，纖毛可以把帶有灰塵、死細胞的黏液掃出氣管，送到喉嚨。其震動方式是一快（fast power stroke）一慢（slow recovery stroke）。
##### Flagella
精子和原生動物都有鞭毛。鞭毛比纖毛長，同樣也有一快一慢的震動。
### Conclusion
| | 中間絲 | 微管|微絲 |
| -------- | -------- | -------- | -------- |
| 直徑（nm） | 10 | 25 | 7 |
| 強度 | 最強 |最弱 | |
| 基本單位|tetramer | tubulin dimer| G-actin monomer|
| 極性 |沒有 | 有 | 有 |
| 基本功能|維持細胞機械強度|運送、固定胞器位置|細胞形狀和運動|
| 代表細胞結構|nuclear lamina|Cilia, Flagella|Microvillus|

\*Microvillus是微絨毛（小腸上皮那個），由微絲撐起。

## Lek.13 Cell Cycle & Cell Death
> 蔣輯武PhD
### Cell Cycle
細胞週期涵蓋G1, S, G2, M四期：G是Gap/Growth，用來衡量細胞內部與外部環境是否適合分裂，並生長準備分裂；S是DNA分裂期；M是細胞核、細胞質分裂期。不同細胞，週期有所不同。例如青蛙早期胚胎細胞只有S和Ｍ，細胞週期只有30分鐘。
#### Cdks週期蛋白依賴性激酶：控制細胞週期
Cdk的活性循環受到Cyclins（不同Cyclin-Cdk Complexes使細胞週期進展到不同階段）、可逆磷酸化反應與蛋白質分解影響。此外，CDK Inhibitor proteins可以阻止Cdk，將細胞週期停留在特定checkpoints。
G1-Cdk使細胞G1期演進；G1/S-Cdk將細胞推向S；S-Cdk則將細胞週期推進至M的前期；M-Cdk（早期被稱為Maturation promotion factor, MPF後確認是M-Cdk, cyclin B/CDK1 complex）也促使M期開始到中期。
外來刺激物如Mitogen(e.g. epidermal growth factor, EGF可刺激cyclin轉錄)可以促進細胞分裂。
#### CDK Complexes家族
| Complex | CDK | Cyclin |
| ------- | ---- | ------ |
| G1 | CDK4/CDK6 | Cyclin D |
| G1/S | CDK2 | Cyclin E |
| S | CDK2 | Cyclin A |
| M | CDK1 | Cyclin B |

#### Cdks的抑制：Ubiquitination
對cyclin的Ubiquitination泛素化，會造成cyclin被proteasome降解，使Cdk被抑制。
#### Cdk的磷酸化
磷酸化位點在Serine, Threonine, Tyrosine上。Kinase可以使物質磷酸化，phosphatase則是去磷酸化。對於Cdk而言，需要被CAK磷酸化、被CDC25去磷酸化才可以發揮活性（兩個磷酸化位點，一個是抑制位點一個是活化位點）。
#### cyclin-Cdk Inhibitor Protein(CKI)
cyclin-Cdk被CKI（例如p27出現在G1-S checkpoint）結合後，會失去活性。CKI會在checkpoint上檢查，若內外在環境不適合分裂，就會結合到Cyclin-Cdk上加以抑制。被抑制的細胞會進入G0期，暫時休息等待適當時機繼續分裂。
#### Mitogen推動細胞進入S期
Mitogen receptor和mitogen結合活化後，會刺激G1-Cdk、G1/S-Cdk。它們會磷酸化Rb，使之不活化。而原本被Rb包裹的E2F就會釋出。
E2F是Transcriptional Factor, 使G1/S和S cyclin被表現出來。
#### S-Cdk和DNA複製
在G1期中，有pre-replicative complex(pre-RC)，由ORC(orgin recognition complex), Cdc6, cdt1, MCM(helicase)組成。S-Cdk會將ORC磷酸化，召集DNA polymerase和其他蛋白形成pre-initiation complex(pre-IC)。活化的MCM開始解開DNA，複製發生。正常而言，一個細胞只會有一次此歷程。
#### M期：Mitosis細胞核分裂和Cytokinesis胞質分裂
##### Mitosis：Prophase, Prometaphase, Metaphase, Anaphase, Telophase
Condensin將Chromatids打包為更密集的結構、Cohesin則是將姊妹染色分體綁在一起。
染色體分裂，由Aster, Kinetochore, Interpolar三種微管共同進行，由Kinesin 4,5,10和Dynein協助。
在Prophase，紡錘絲就開始形成，而紡錘絲與染色體在Prometaphase連上，核膜崩解。metaphase，染色體排列在細胞中央赤道板；anaphase，染色體分離。Mitotic exit發生。在telophase，核膜重新出現。
##### Cytokinesis
在胞質分裂時，細胞膜內由actin, myosin II（actomyosin network, coupled with Rho GTPase）形成contractile ring，表面上出現分裂溝cleavage furrow，促使胞質分裂完成。
#### Checkpoint
- G1 checkpoint:確認環境是否適合（mitogen的存在、內在資源足夠）
- mitogen的檢查方式：有mitogen，可以使G1, G1/S CDK磷酸化Rb，釋出E2F，表現G1/S, S CDK
- 有DNA毀損，會使P53磷酸化，轉錄出P21 CKI阻止複製
- G2/M checkpoint:DNA是否完全複製並修復
- 若DNA未被完全複製、修復，CDC25不會把M-CDK去磷酸化
- metaphase checkpoint:是否所有染色體都與紡錘絲連結好
- 若未連接好，APC不會活化，Cohesin不會斷開
:::success
G1/S checkpoint和G2/M checkpoint上有p53，是重要抑癌基因，避免DNA受損傳到下一代細胞。許多癌症上都可找到此基因突變。
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### Cell Death
程式性細胞死亡（Programmed Cell Death, PCD）可分為Apoptosis（細胞凋亡）和non-apoptosis兩種。PCD由基因控制，常在胚胎發育時發生（例如手指產生、蝌蚪變青蛙的metamorphosis）。成熟個體的細胞凋亡，則與生理恆定有關。
#### Apoptosis: Bcl2 Family
Bcl2家族有prosurvival和proapoptotic(killer)兩種類型。Bcl2屬於促活，可以抑制促死蛋白。**Bax,Bak是主要的促死蛋白**，會形成oligomers多聚體，刺穿粒線體外膜啟動mitochondria-dependent intrinsic pathway。通常當細胞經歷了無法復原的傷害後，就會活化Bax和Bak使細胞走向凋亡。
#### Mitochondria-dependent intrinsic pathway
缺乏survival factors, 高UV濃度或感染時，會造成Bak, Bax等蛋白打破粒線體外膜，釋出**Cytochrome C**，與細胞質內的**Apaf-1**, ATP構成像一朵花一樣的Apoptosome凋亡複合體。
凋亡複合體會招集procaspase-9，活化之，成為caspase-9。
:::success
caspase（cysteine-dependent aspartate specific protease）是凋亡蛋白酶，兩個procaspase單體湊在一起，去掉prodomains後，會形成homodimer，具有兩個活性位。initiator caspase(e.g. caspase-9, caspase-8)再活化更多executioner caspase，形成類似連鎖反應。
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#### Extrinsic apoptosis pathway
殺手淋巴球可以透過其他細胞上的**death receptor**啟動其他細胞的死亡程序。例如用過的淋巴球、被病毒感染的細胞、癌細胞。這些Death receptor包含**TNFR superfamily**中的Fas和TNFR(tumor necrosis factor receptor)。
以Fas為例，外來訊號Fas-L(Fas Ligand)刺激之後，會吸引adaptor protein, **procaspase-8**形成DISC(death-inducing signaling complex)。procaspase-8會活化，繼續活化下游的excutioner caspase，造成凋亡。
### Aging & Cell Senescence
老化的學說有很多，包括免疫系統老化或細胞老化。所謂cell senescence，是指細胞週期的永遠停滯。決定細胞週期停滯的因素稱為Hayflick factors，包含：
1. telomere shortening
2. accumulation of DNA/chromosomal damage
3. activation of CKI, including Arf(p14, p19) & INK4a(p16) expression

Hayflick factors導致p53, Rb表現，使細胞週期停下。

:::info
#### 各種蛋白整理，有些名字很像，呵
| 名字 | 功能 |
| ------- | ------------------------------------------------ |
| Rab | GTPase，和囊泡結合使目標膜上的Rab effector辨識 |
| Ran | GTPase，能協助跨蛋白運輸入細胞核 |
| Ras | GTPase，被RTK活化 |
| Rb | 抑制E2F，阻止G1/S, S cyclin被表現 |
| Rac | GTPase，Rho家族，促進lamellipodium產生 |
| Rho | GTPase，Rho家族，促進stress fiber產生 |
| CDC42 | GTPase，Rho家族，促進Filopodium產生 |
| CDC25 | Phosphatase，使CDK去磷酸化，可以活化CDK |
| P53 | 偵測DNA異常的蛋白，可以作為P21的轉錄因子 |
| P21 | CKI，可以抑制G1/S CDK和S CDK |
| P27 | CKI，課本沒特別說抑制誰 |
| APC | M檢查點，確保紡錘絲連接妥善，否則不讓cohesin斷裂 |
| Bcl2 | Bcl2家族，抑制凋亡 |
| Bax/Bak | Bcl2家族，打破粒線體啟動凋亡 |
| PKA | 被G-protein $\alpha$次單元啟動，入核活化轉錄因子 |

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