# Organic Chemistry Final
>授課：國立成功大學醫學系 陳毓宏教授
## Thermodynamics
### 基本概念
熱力學考慮的，是反應是否**自發**與其平衡。會反覆出現的物理量包括$\Delta G,\ \Delta S,\ \Delta H$。其中，決定反應是否自發發生的，是$\Delta G$(Gibb's free energy)。只有當$\Delta G<0$反應才會自發。
#### 熱力學基本定律
- **第0定律**：定義溫度，並指出兩個相互接觸的系統，其熱流的方向
- **第1定律**：指出內能作為獨立的系統
- **第2定律**：熵是研究不可逆過程的物理量，說明熱力學過程向外界能做多少熱力學功
- **第3定律**：不可能透過有限過程使系統降至絕對零度
### 可逆與不可逆過程
#### 先看定義
- enthalpy($\Delta H$, $q$)
- 是**定壓**下發生反應時，系統和環境的熱能交換
- 斷鍵吸熱、形成鍵結放熱
- entropy($\Delta S$)
- 系統的熵由分子數、隨機度、自由度決定
- 分子數越多、自由度越高，熵越大
- $S=k_B\cdot ln\Omega$
- $k_B$是Boltzmann's constant
- $\Omega$是microstates數
- internal energy($\Delta E$)
- 根據第一定律，$\Delta E=q+w$
- $q$是系統吸收的熱
- $w$是系統對外做的功
#### Isothermal Process
##### 前提說明
注意到在理想氣體中，內能($E$)只和溫度有關。因此，在等溫過程中$\Delta E=0$。而由於$PV=nRT$，在溫度不變情況下，$\Delta(PV)=0$。
因為$\Delta E=q+w=0$，$q=-w$。
##### Free Expansion(Case I)
如果活塞完全不受壓力（$P_{ext}=0$），則$\Delta E=q=w=0$。
##### One-Step Expansion Against $P_f$(Case II)
假設$P_f=\frac{1}{4}P_i$（i是initial, f是final）。
則：$w_{II}=-P_f\Delta V=-P_f(V_f-V_i)=-\frac{1}{4}P_i(4V_i-V_i)=-\frac{3}{4}P_iV_i$是系統對外做的功。
因此，需要有$q_{II}=-w_{II}=\frac{3}{4}P_iV_i$的熱流入系統。
##### Two-Step Expansion(Case III)
###### Step 1: Against $\frac{1}{2}P_i$
$w_{s1}=-\frac{1}{2}P_iV_i$
###### Step 2: Against $\frac{1}{4}P_i=P_f$
$w_{s2}=-\frac{1}{2}P_iV_i$
###### work total
$w_{III}=w_{s1}+w_{s2}=-P_iV_i$
##### 觀察一下
發現$|w_{III}|>|w_{II}|>|w_I|$。這有一點類似微積分中的下和（expansion）的情形，切的越細就越逼近曲線下實際面積。所以，若是切的無限細，就會是Infinite-step expansion。expansion像下和，則compression就像上和，是從曲線上去逼進曲線下實際面積。所以，當切的無限細，上和與下和就會相等，也就是氣體最多可以做的功。由於此時expansion和compression做的功相等，它是一個**reversible**的過程。但實際上幾乎不可能做到無限多步驟，因此現實中的過程都是**irreversible**。
##### Infinite-Step Expansion
$w_{max}=-\int^{V_f}_{V_i}PdV=-\int^{V_f}_{V_i}\frac{nRT}{V}dV=-nRT\int^{V_f}_{V_i}\frac{1}{V}dV=-nRTln\frac{V_f}{V_i}$
所以：$w_{max}=-nRTln\frac{V_f}{V_i}=w_{rev}$
##### 等溫過程：結論
$w_{max}=w_{rev}=-nRTln\frac{V_f}{V_i}$
$q_{max}=-w_{rev}=nRTln\frac{V_f}{V_i}$
#### Cyclic Process
在等溫循環過程中，若是**可逆過程**，則由於壓縮時放熱和膨脹時吸熱量值相同，因此$q_{net}=q+q^\prime=0,\ w_{net}=0$。此時，環境與系統都回到初始狀態。

若為**不可逆過程**，則$w_{net}=(-\frac{3}{4}+3)P_1V_1=2.25P_1V_1$（假設是one-step expansion+compression, $P_2=\frac{1}{4}P_1$）。因此，$q_{net}=-2.25P_1V_1$。在這個過程中，系統以向外做功的方式放出熱，有序能量（work）被轉換為無序能量（heat）。雖然系統回到初始狀態，但環境已經被改變。**現實中，所有過程都是不可逆**。此外，對於不可逆循環，則$\frac{q_{irr}}{T}<0$。
#### Entropy & q
前面提及，$S=k_B\cdot ln\Omega$。故$\Delta S=S_f-S_i=k_B(ln\Omega_f-ln\Omega_i)=k_b\frac{\Omega_f}{\Omega_i}$。

又對於氣體而言，$\Omega\propto V$。因此，$\Delta S=k_bln\frac{\Omega_f}{\Omega_i}=k_bln\frac{V_f}{V_i}=nRln\frac{V_f}{V_i}$。
同時，$q_{rev}=nRTln\frac{V_f}{V_i}$。因此，可以得到$\Delta S=\frac{q_{rev}}{T}$。

### Gibbs Free Energy ($G$)
定義：$G=H-TS$。
因此，$\Delta G=G_f-G_i=(H_f-TS_f)-(H_i-TS_i)=(H_f-H_i)-T(S_f-S_i)$。化簡後得：$\Delta G=\Delta H- T\Delta S$。
#### 自發性
對於所有自發過程，$\Delta S_{univ}>0$。此外，$\Delta S > \frac{q_{irr}}{T}$。對於等壓過程，$q_p=\Delta H$。因此，可改寫為$\Delta S > \frac{\Delta H}{T}$，移項得$T\Delta S-\Delta H>0$。又，$T\Delta S- \Delta H=-\Delta G>0$。
故可知，對於自發反應而言，在等溫等壓條件下，$\Delta G<0$。
#### Free Energy的本質
$\Delta G=\Delta H-T\Delta S$（定溫）(1)
$\Delta H=\Delta E+P\Delta V$（定壓）(2)
$\Delta E=q_p+w$ (3)
$\Delta S=\frac{q_{rev}}{T},\ T\Delta S=q_{rev}$ (4)

將式(4)、(3)、(2)帶入式(1)，得$\Delta G=q_p+w+P\Delta V-T\Delta S=(q_p-q_{rev})+w+P\Delta V$ (1-1)。

定義$w=w_{useful}+w_{PV}=w_{useful}-P\Delta V$ (5)。其中，PV功大多數是無用的。

將(5)帶入(1-1)，得$\Delta G=(q_p-q_{rev})+w_{useful}$ (1.2)

此外，$q_p\le q_{rev},\ q_p-p_{rev}\le0$。當過程為可逆時，等號成立。因此，若為可逆過程，則$\Delta G=w_{useful}$；若為不可逆過程，則$\Delta G$有部分會被以熱的形式放出，無法完全用於做功。

換言之，$\Delta G$就是理論上最大可做的功。$\Delta G=w^{max}_{useful}$。
### 再探自發性：從熵出發
首先，$\Delta S_{tot}=\Delta S_{surr}+\Delta S_{sys}$ (1)。

又，已知在等溫等壓過程，$\Delta S = \frac{q_p}{T}$。因此，$\Delta S_{surr}=\frac{q_{surr}}{T}=-\frac{\Delta H_{sys}}{T}$ (2)。

(2)帶入(1)得$\Delta S_{tot}=-\frac{\Delta H_{sys}}{T}+\Delta S_{sys}$ (1.1)
移項得 $-T\Delta S_{tot}=\Delta H_{sys}-T\Delta S_{sys}$ (1.2)
又$\Delta G=\Delta H-T\Delta S$，因此$\Delta G =-T\Delta S_{tot}=\Delta H_{sys}-T\Delta S_{sys}$。
由此推導過程可知，$\Delta H$和環境熵變有關，$t\Delta S$則是和系統熵變有關。
#### $\Delta H,\ \Delta S,\ T$和自發性的關係
$\Delta H<0,\ \Delta S>0$：所有溫度下，均自發（$\Delta G<0$）
$\Delta H<0,\ \Delta S<0$：低溫下自發
$\Delta H>0,\ \Delta S>0$：高溫下自發
$\Delta H>0,\ \Delta S<0$：所有溫度下，**均不自發**
### Free Energy & Equilibria
若將反應物與產物的Free Energy畫出，可以發現吸能（endergonic）反應不自發，放能（exergonic）反應自發。
此外，注意到$G^\circ$的定義是1 atm下的自由能。因此$G=G^\circ+RT\cdot lnP$。
因此，$\Delta G^\circ$是標準狀態下的自由能變化。$\Delta G = \Delta G^\circ + RT\cdot lnQ$ ($Q$為反應商)。
反應達平衡時，$Q=K_{eq},\ \Delta G=0$。因此，$0=\Delta G^\circ+RT\cdot lnK_{eq}$。
移項得：$\Delta G^\circ=-RT\cdot lnK_{eq}$。
## Kinetics
熱力學只涉及反應平衡、是否自發等問題，無法處理反應速率的問題。因此，自發反應可能很快（例如爆炸）也可能非常慢（例如鑽石變石墨）。熱力學只處理初始與最終狀態，動力學處理反應途徑。
反應速率$r=k[Reactants]^a$。$k$為反應速率常數，$[Reactants]^a$則為濃度與反應**級數**。
$k=Ae^{-\frac{E_a}{RT}}$為阿瑞尼斯方程式。其中，$E_a$為反應活化能。分子必須越過活化能，才可能有效碰撞。因此，快速反應中的活化能較小。在高溫情境下，有更多分子可以越過活化能，因此反應速率較大。
催化劑的功能就是**改變反應途徑**以降低活化能。但是催化劑不影響反應平衡或產物/反應物的能量。
### 動力學和熱力學共同影響反應
| 特性 | 動力學產物 | 熱力學產物 |
| -------- | -------- | -------- |
| $E_a$| 低（反應快）| 高（反應慢）|
| $\Delta G$| 小（產物較不穩定）| 大（產物更穩定）|
| 溫度偏好 |低溫多 |高溫多 |
| 可逆性 |常見不可逆 |常見可逆 |

因為高溫狀態下，更多分子可以跨越活化能，因此更傾向熱力學控制。
### Transition States & Intermediates
過渡態（Transition States）是反應途徑中能量的頂峰，難以分離、觀察，並非穩定物種（**SN2反應出現**有五個鍵結的碳）。
中間體（Intermediate）則是能量相對較低點，為中間產物，可以觀察（**SN1反應出現**只有三個鍵結的碳）。
#### Hammond Postulate
在同一個反應途徑中，能量越相近者結構越相近。
## Stereoisomerism
異構物可分為組成和結構異構物。立體異構物（stereoisomer）中原子的連接方式相同，但空間指向不同。立體異構物又可分為對映異構物（Enantiomers）和非對映異構物（Diastereomers）。
### Enantiomers
對映異構物的定義是，其鏡像結構與其不同（nonsuperimposable）。我們稱為Chiral；鏡像結構與其可以完全重疊的，稱為achiral。achiral的化合物，至少要有一個對稱平面。至於chiral的判斷方式，則是檢查是否有**一個碳所連接的四個基團都不同**，這個碳稱為chiral center。
#### R-S configuration
判斷R/S的方式，是先幫Chiral center周圍的四個基團編號。最靠近chiral center的四顆原子，原子序越大順位越高。順位最低的，遠離自己，看順位1-2-3是順時針（R）或逆時針（S）排列。若比到第二層，要把雙/參鍵當成2/3個單鍵，用字典序比較法。例如：COOH的是[8,8,8]（雙鍵O當成兩個O，總共三個O），CONH~2~是[8,8,7]（雙鍵O當成兩個O，總共兩個O一個N）第一、二順位的8一樣，就比到第三順位的8-7，所以COOH>CONH~2~。
#### E-Z configuration
除了對映異構物外，雙鍵也會形成立體異構物。常見的分別是順反（cis-trans）異構物。更廣泛使用的，是E(entgegen)-Z(zusammen)異構物。用R-S異構物同樣的方式將雙鍵周圍四個基團標定後，高順位基團在同側（類似順式cis）的就是Z；低順位基團在同側（類似反式trans）的就是E。
#### Dex-Lev configuration
Dex是右旋光性、Lev是左旋光性，與R-S異構物並無法直接對應，需觀測。
#### Mesocompound內消旋化合物 v. Racemic mixture外消旋混合物
內消旋化合物是有兩個以上的chiral center時，可能發生出現對稱平面的情形。此情形下，化合物的鏡像可能相互重疊。
外消旋混合物則是兩對映異構物的等量混合。
#### Fischer Projection
所有橫線代表出紙面的鍵，直線代表入紙面的鍵。
### Conclusion: For compounds with chiral centers
- 是否為鏡像？
- 否：diastereomers-部分chiral centers轉向，但非全部。optically active
- 是：是否為superimposable?
- 是：mesocompound-分子內有對稱平面，optically inactive
- 否：Enationmers-所有chiral centers轉向，optically active

## Mechanisms
反應機構包括：
1. Nucleophilic Attack
2. Loss of a leaving group
3. Proton Transfers(Acid/Base)
4. Carbocation Rearrangement

以下僅就1.4.說明。
### Nucleophilic Substitutions
親核取代分為S~N~1和S~N~2兩種。S~N~1是先leaving group自己離開，形成碳陽離子後取代基再進行親核攻擊。S~N~2則是親核基直接撞上碳離子，形成transition state，同時發生脫去反應。因此，S~N~2需要更強的親核基，且結構較固定（分子較滿，只能從特定位置進行取代）。
#### S~N~2: Subsitution Nucleophilic 2 molecular(2 species in rate-determining step)
- rate（速率決定步驟RDS：活化能Ea最大）由鹵烷類和親核基共同決定
- 背向攻擊（backside）
- 波函數的overlapping比較好(binding MO)
- 若從前向攻擊：變成nonbinding MO(binding+anti-binding)，不好
- 另一解釋：前向鹵烷是$\delta^-$，後向C是$\delta^+$，親核攻擊要找$\delta^+$所以找後向
#### S~N~1
- rate只由鹵烷類決定
- 鹵烷脫去後形成平面三角形，親核基可以從上或下攻擊（挑脫去的鹵烷濃度低處）

### Carbocation
碳陽離子的穩定度，受到hyperconjugation, induction等效應的影響。terriary（連了三個R）的碳陽離子最穩定（穩定度：tertiary>secondary>primary>methyl即沒連接任何R的）。因為R是Induction EDG，可以穩定碳陽離子上的正電荷，越多烷基連在碳陽離子上，其越穩定。Hyperconjugation，則是碳陽離子**旁**的烷基上的C-H/C-X鍵，可以跑到碳陽離子的空p軌域上，使其穩定。
#### Carbocation Rearrangement
碳陽離子**隔壁**碳上的氫或甲基可能帶著兩顆電子跳到陽離子上，使陽離子遷移。這種情況可以使碳陽離子更穩定，因為新的碳陽離子是tertiary。所以，如果原本的碳陽離子就是tertiary，通常遷移不會發生，除非遷移後可以造成穩定的共振結構。（這種位置稱為allylic烯丙基 position，隔壁有一個雙鍵）
### Reversibility
- Nucleophilic
- 如果nucleophile是好的leaving group，反應可逆
- 如果nucleophile不是好leaving group，不可逆
- Loss of a leaving group
- 如果leaving group是好的nucleophile，可逆
- Proton Transfer
- 如果pKa差距>10，不可逆
## Application: Biochemistry
### 一些概念
- Stability: Chair>Boat>Half-Chair>Plane（老師把半椅跟船寫反）
- TS和Intermediate的判斷：intermidiate有真實的鍵在形成或斷裂
- 驗證方式：
- KIE-用同位素標定不同的原子，觀察反應速度變化
- 設計會卡在TS的analog
- 理論計算
- X-Ray
- 質子解離或不解離？要看環境是否能承接proton
### 例題A：Asp102,His57,Ser195蛋白酶（Credit to Grok）

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#### 1. **催化三聯體的結構與角色**
- **Ser195（絲氨酸）**：提供親核性的羥基（-OH），作為反應的親核試劑，直接攻擊底物肽鍵的羰基碳。
- **His57（組氨酸）**：作為酸鹼催化劑，通過其咪唑環接受和捐獻質子，增強 Ser195 的親核性和穩定反應中間體。
- **Asp102（天冬氨酸）**：通過其羧基負電荷與 His57 的咪唑環形成氫鍵，穩定 His57 的質子化狀態，增強其酸鹼催化能力。

這三個氨基酸通過氫鍵網絡精確排列在酶的活性中心，形成高效的催化系統。

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#### 2. **反應機制：雙四面體中間體機理**
絲氨酸蛋白酶切割肽鍵的反應屬於親核取代反應，涉及兩個四面體中間體的形成。以下是詳細步驟（以胰凝乳蛋白酶為例）：

##### **步驟 1：底物結合**
- 底物（蛋白質或多肽）進入酶的活性位點，肽鍵的羰基碳（C=O）與 Ser195 的羥基靠近。
- 底物的特定氨基酸側鏈（例如，胰凝乳蛋白酶偏好芳香族氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸）與酶的結合口袋（S1 位點）相互作用，確保底物的特異性定位。

##### **步驟 2：親核攻擊與第一四面體中間體形成**
- **Ser195** 的羥基氧原子作為親核試劑，攻擊底物肽鍵的羰基碳，形成一個四面體中間體（tetrahedral intermediate）。
- **His57** 的咪唑環從 Ser195 的羥基中提取一個質子（作為鹼），增強 Ser195 氧原子的親核性。
- **Asp102** 的負電荷通過氫鍵穩定 His57 的質子化狀態，使 His57 更容易接受質子。
- 四面體中間體的負電荷（來自羰基氧）被酶的氧陰離子孔（oxyanion hole，通常由主鏈 NH 基團組成，如 Gly193 和 Ser195 的 NH）穩定。

**化學示意**：

底物：R1-C(=O)-NH-R2
Ser195-OH + His57 → Ser195-O⁻ + His57-H⁺
Ser195-O⁻ 攻擊 C=O → 四面體中間體 [R1-C(O⁻)(O-Ser195)-NH-R2]

##### **步驟 3：酰基-酶中間體形成**
- 四面體中間體崩解，肽鍵的 C-N 鍵斷裂，釋放出胺端產物（R2-NH2）。
- His57 作為酸，將質子捐獻給離開的胺基（-NH2），促進 C-N 鍵斷裂。
- Ser195 的氧原子與底物的羰基碳形成共價鍵，生成酰基-酶中間體（acyl-enzyme intermediate，R1-C(=O)-O-Ser195）。
- 氧陰離子孔繼續穩定中間體的負電荷。

**化學示意**：

四面體中間體 → R1-C(=O)-O-Ser195 + H2N-R2

##### **步驟 4：水分子親核攻擊與第二四面體中間體形成**
- 一分子水進入活性位點，作為新的親核試劑。
- His57 從水分子中提取質子，生成羥基離子（OH⁻），該羥基離子攻擊酰基-酶中間體的羰基碳，形成第二個四面體中間體。
- Asp102 再次穩定 His57 的質子化狀態，氧陰離子孔穩定四面體中間體的負電荷。

**化學示意**：

H2O + His57 → OH⁻ + His57-H⁺
OH⁻ 攻擊 R1-C(=O)-O-Ser195 → 四面體中間體 [R1-C(O⁻)(OH)-O-Ser195]

##### **步驟 5：產物釋放與酶再生**
- 第二四面體中間體崩解，Ser195 的氧原子離開，釋放出羧基端產物（R1-COOH）。
- His57 將質子捐獻給 Ser195，恢復其羥基（-OH），使酶回到初始狀態，準備下一輪催化。

**化學示意**：

四面體中間體 → R1-COOH + Ser195-OH

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#### 3. **催化三聯體的協同作用**
- **Ser195** 提供親核攻擊的活性中心。
- **His57** 作為質子穿梭器，促進質子轉移，降低反應的活化能。
- **Asp102** 通過電荷中繼（charge relay）穩定 His57 的構象和質子化狀態。
- 氧陰離子孔（非三聯體部分）穩定四面體中間體的負電荷，進一步降低反應能壘。

這種協同作用使絲氨酸蛋白酶能夠高效催化肽鍵水解，反應速率比非催化條件下快數百萬倍。

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#### 4. **簡單示意圖**
以下是反應機制的文字示意：

1. 底物結合：R1-C(=O)-NH-R2 進入活性位點
2. Ser195-OH 攻擊羰基碳 → 四面體中間體（His57 提取質子，Asp102 穩定）
3. 釋放 R2-NH2 → 酰基-酶中間體 (R1-C(=O)-O-Ser195)
4. H2O 攻擊 → 第二四面體中間體
5. 釋放 R1-COOH，酶恢復 (Ser195-OH)

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### 例題B：Lysozyme（Credit to Grok）
溶菌酶（Lysozyme）是一種廣泛存在於生物體（如人類淚液、唾液和蛋清）中的酶，能催化細菌細胞壁中**肽聚糖**（peptidoglycan）的醣類骨架的水解，特別是切割 **N-乙醯葡糖胺（NAG）** 和 **N-乙醯胞壁酸（NAM）** 之間的 β-1,4-糖苷鍵。以下是溶菌酶切割醣類的詳細反應機制的說明，重點聚焦於其催化機制和關鍵氨基酸（如 Glu35 和 Asp52 在雞蛋清溶菌酶中的角色）。

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#### 1. **溶菌酶的背景**
- **底物**：溶菌酶的主要底物是細菌細胞壁中的肽聚糖，特別是 NAG-NAM 重複單元之間的 β-1,4-糖苷鍵。溶菌酶的活性位點可容納六個糖單元（標記為 A 至 F 位點），切割通常發生在 D 和 E 位點之間的糖苷鍵。
- **活性位點**：在雞蛋清溶菌酶（hen egg-white lysozyme, HEWL）中，催化中心主要由 **Glu35**（穀氨酸）和 **Asp52**（天冬氨酸）組成，兩者協同作用催化糖苷鍵的水解。
- **反應類型**：溶菌酶催化水解反應，屬於酸鹼催化機制，涉及四面體中間體的形成。

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#### 2. **反應機制：酸鹼催化與四面體中間體**
溶菌酶的水解機制通常被描述為 **保留構型（retaining mechanism）**，即底物的 β-糖苷鍵在水解後保持 β 構型。該機制分為兩個主要步驟，涉及 Glu35 和 Asp52 的協同作用。以下是詳細步驟：

##### **步驟 1：底物結合**
- 底物（NAG-NAM 六糖單元）結合到溶菌酶的活性位點，跨 A 至 F 位點。
- 活性位點的結構導致底物在 D 位點的糖環發生扭曲，從而形成一個半椅型（half-chair）或船型（boat）構象。這種扭曲使 D 位點的糖苷鍵（D 和 E 之間的 β-1,4-鍵）更容易受到親核攻擊。
- **Glu35** 和 **Asp52** 位於活性位點的兩側，靠近 D-E 糖苷鍵：
- **Glu35** 的羧基（-COOH）通常處於質子化狀態，作為質子供體（酸）。
- **Asp52** 的羧基（-COO⁻）帶負電荷，作為親核試劑或穩定劑。

##### **步驟 2：糖苷鍵斷裂與四面體中間體形成**
- **Glu35 作為質子酸**：Glu35 的質子化羧基（-COOH）將質子（H⁺）捐獻給糖苷鍵的氧原子（D 和 E 位點之間的 β-1,4-鍵中的氧）。這使糖苷鍵的氧原子質子化（-O- → -OH），促進 C-O 鍵的斷裂。
- **Asp52 作為親核劑或穩定劑**：
- **經典機制（共價中間體）**：Asp52 的負電荷羧基（-COO⁻）攻擊 D 位點糖環的 C1 碳（糖苷鍵的羰基碳），形成一個共價的四面體中間體（oxocarbenium ion-like transition state）。這一步中，D 位點的糖環形成一個帶正電的過渡態，Asp52 的負電荷穩定該過渡態。
- **替代機制（非共價穩定）**：近年研究表明，Asp52 可能不直接形成共價中間體，而是通過靜電作用穩定 D 位點 C1 碳上的正電荷（oxocarbenium ion），促進四面體中間體的形成。
- 糖苷鍵斷裂，E-F 位點的糖單元（NAM 或 NAG）作為離去基團釋放，留下 D 位點的糖與 Asp52 形成中間體（或被 Asp52 穩定）。

**化學示意**：

底物：NAG(D)-O-C4-NAM(E)
Glu35-COOH → 捐獻 H⁺ 給糖苷氧 → -OH（離去基團）
Asp52-COO⁻ → 穩定 C1 碳正電荷或形成共價中間體 [NAG(D)-C1-O-Asp52]

##### **步驟 3：水分子親核攻擊**
- 一分子水進入活性位點，作為親核試劑。
- 水分子攻擊 D 位點 C1 碳上的正電荷（或共價中間體的 C1 碳），形成第二個四面體中間體。
- **Asp52** 穩定過渡態（或釋放共價鍵），而 **Glu35**（現為去質子化狀態，-COO⁻）可能通過吸引水分子中的質子，促進水分子生成羥基離子（OH⁻），增強其親核性。
- 最終，D 位點的糖環恢復為 β-羥基構型，釋放出水解產物（A-D 位點的糖單元）。

**化學示意**：

H2O + [NAG(D)-C1-O-Asp52] → NAG(D)-C1-OH + Asp52-COO⁻

##### **步驟 4：產物釋放與酶再生**
- 水解產物（A-D 位點的糖單元和 E-F 位點的糖單元）從活性位點釋放。
- Glu35 恢復質子化狀態（-COOH），Asp52 保持負電荷（-COO⁻），酶回到初始狀態，準備下一輪催化。

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#### 3. **關鍵特點**
- **保留構型**：溶菌酶的水解反應保留了 D 位點 C1 碳的 β 構型，這與雙位移機制的特徵一致（涉及兩個四面體中間體）。
- **D 位點扭曲**：底物在 D 位點的糖環扭曲成非平面構象（半椅型或船型），降低了糖苷鍵斷裂的活化能。
- **Glu35 和 Asp52 的角色**：
- **Glu35** 作為酸催化劑，質子化糖苷氧，促進離去基團的離開。
- **Asp52** 穩定過渡態的正電荷（或形成短暫的共價中間體），確保反應高效進行。
- **氧碳正離子（Oxocarbenium ion）**：反應中間體的 C1 碳形成一個類似氧碳正離子的過渡態，由 Asp52 和活性位點的氫鍵網絡穩定。

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#### 4. **催化效率**
- 溶菌酶通過 Glu35 和 Asp52 的協同作用，以及活性位點的精確結構（如氫鍵網絡和底物扭曲），將糖苷鍵水解的速率提高數百萬倍。
- 底物在 D 位點的扭曲和 Asp52 的靜電穩定降低了反應的活化能。

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#### 5. **簡單示意圖**
以下是溶菌酶催化機制的文字示意：

1. 底物結合：NAG(D)-O-C4-NAM(E) 進入活性位點，D 位點糖環扭曲
2. Glu35-COOH 捐獻 H⁺ → 糖苷氧質子化 (-O- → -OH)
3. Asp52-C1 碳正電荷 → 四面體中間體，E-F 位點離去
4. H2O 攻擊 C1 碳 → 第二四面體中間體 → NAG(D)-OH
5. 產物釋放，酶恢復

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#### 6. **注意事項**
- **機制爭議**：早期認為溶菌酶通過共價中間體（Asp52 與 C1 碳形成共價鍵）進行催化，但近期結構和計算研究支持非共價機制的可能性（Asp52 僅穩定過渡態）。
- **物種差異**：不同來源的溶菌酶（如人類溶菌酶或 T4 噬菌體溶菌酶）可能有細微的機制差異，但 Glu35 和 Asp52 的角色在雞蛋清溶菌酶中是典範。
- **抑制劑**：一些糖類衍生物（如 NAG 的寡聚物）可作為競爭性抑制劑，結合活性位點阻斷催化。