Paulina J. Villaseñor
Laboratorio de Conectividad Cerebral C13
Instituto de Neurobiología, UNAM

# Receta Inmunofluorescencia

PASOS:

1.- Comenzamos con un bloqueo de membrana con BSA 2% + 0.3% de tritón durante 45 minutos.
2.- Incubación del anticuerpo primario diluido con BSA 2% + 0.3% de tritón por 24 horas, no estrictamente, pueden ser menos horas, alrededor de 20 está bien.
3.- Posterior a la primer incubación se procede a lavar el tejido 3 veces por 10 minutos con solución PBS 1X.
4.- Incubación del segundo anticuerpo(Alexa) diluído con BSA 2% + 0.3% de tritón durante 4 horas.
5.- Terminada la incubación se vuelve a lavar el tejido 3 veces durante 10 minutos con PBS 1X.
6.- Montaje

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*Recomendaciones:*

Preparar el BSA 2% + 0.3 tritón **en el momento**.
El PBS 1X de preferencia también que sea fresco.
La agitación debe de ser moderada.
No utilizar múltiples marcajes con mismo host.
Al montar procurar que la rebanada quede sin residuos de PBS 1X.
Procurar no dejar burbujas a la hora del pipeteo.

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Ejemplo.

Vamos a realizar una inmuno con MBP y NeuN en 4 rebanadas, lo cual equivale a un Vt de 800 ul (200ul por rebanada)
MBP esta hecho en rabbit y NeuN en mouse, por lo tanto son compatibles para doble marcaje.

Primero tenemos que tener la concentración del anticuerpo bien estandarizada. En este caso nosotros en el laboratorio utilizamos la siguiente concentración:

| Ac | Concentración |
| --- | ------------- |
| NeuN | 1:350 |
| MBP | 1:200 |

Una vez teniendo la concentración, se procede a elaborar las soluciones en **el momento**.
Como tenmos un Vt de 800ul se realizá una simple regla de tres:

800ul para bloqueo de membranas

BSA Tritón PBS 1X
800ul - 100% 800ul - 100% 800ul - 16 - 2.4
x - 2% x - 0.3% = 781.6 ul
= 16mg (convertimos a g) = 2.4 ul

TOTAL = 800ul

800ul para diluir los anticuerpos
Mismo procedimiento para preparar BSA 2% + 0.3 tritón

Para saber en que cantidad de solución se van a diluir los anticuerpos se realizá la siguiente operación:

MBP 1:200
400 ul/200 ul = 2 Ac
400ul - 2 Ac = 398 ul de BSA 2% + 0.3 tritón

NeuN 1:350
400 ul/350 ul = 1.1 Ac
400ul - 1.1 Ac = 398.9 ul de BSA 2% + 0.3 tritón

Como tenemos 800ul de Vt y es doble marcaje, solamente necesitamos 400ul de cada Ac primario.

Ahora, para los Ac secundarios o tambien llamados Alexas se va a realizar el mismo procedimiento de arriba. Asegurarse de que el Alexa es del **mismo host** que el Ac primario. Por ejemplo:

> MBP anti-rabbit es compatible con el Alexa 555 anti-rabbit
> NeuN anti-mouse es compatible con el Alexa 488 anti-mouse

Diluimos nuestros Alexas:

Alexa 555 1:500
400ul / 500ul = 0.8ul
400ul - 0.8ul = 399.2ul de BSA 2% y 0.3 triton

Alexa 488 1:500
400ul / 500 = 0.8ul
400ul - 0.8 = 399.2ul de BSA 2% y 0.3 triton

Montaje

Existen muchas maneras de realizar este último paso y dependerá de que técnica se te facilite más. Algunos tips que a mi me han funcionado son:

1.- Mover la rebanada del pozo al porta objetos con el pincel
2.- Una vez que esta bien extendida la rebanada, asegurarla con el pincel e inclinar el porta objetos para retirar el líquido y la rebanada quede bien adherida.
3.- Dejar secar la rebanada por un par de minutos (aquí aprovechas para montar la rebanada siguiente)
4.- Si el pegamento que utilizas es muy denso, espera un par de minutos antes de sacar la puntilla del tubo de donde se extrae el pegamento, así evitaras burbujas.
5.- Coloca una gota de pegamento sobre la rebanada, yo utilizó 100ul por porta objetos.
6.- Y por ultimó y mas complicado, a la hora de colocar el cubre objetos, acercalo lo mas posible a la superficie y dejalo caer, lo difícil es evitar las burbujas.