# NanoString's GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)
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實驗室主持人: 醫學系黃韻如(Ruby Huang) 教授 (分機288399) [e-mail]
實驗室位置: 台大醫學院 基礎醫學大樓 1413室
實驗室助理: 陳可楨 (分機288264) [e-mail]
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## Platform and Principle
Source:Nanostring
**[==> 更多資訊關於Nanostring Geomx請點此連結](https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview/)**

## 樣本準備

* 使用玻片建議

* 5 um的石蠟切片或5-10 um的冷凍切片皆可，貼於下圖所示玻片的綠色區域內。
* RNA實驗的樣本建議是二週內的新鮮切片，石蠟切片請置於4度乾燥環境下保存。Protein實驗的樣本室温保存即可。(RNA實驗請務必先確認實驗日期再開始準備實驗切片，避免切片放置過久)

## ROI圈選注意事項
* 貼於上圖綠色區域部份的都可被圈選。
* 圈選可以是圓形，方形或多邊形。圖形的話最大可圈選直徑660 um的大小，方形最大可圈選660 um x 785 um，多邊形最大的範圍同方形，也是660 um x 785 um。
* 每個組別的ROI務必選擇三個以上(四個會更保險)，不然後續無法做統計分析。
* RNA的實驗，每個ROI至少要有200個細胞。Protein的實驗，每個ROI至少要有20個細胞。後續定量才會精確。

## 合作模式 (本實驗室提供DSP機器供各研究人員使用，並協助使用者上機使用機器，無另外收操作費，使用者需自行操作片子染色等步驟及實驗結果分析)

**1. 諮詢 : 請連繫黃韻如教授**
**2. 訂購所需試劑: 請連繫研究助理陳可楨**
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**RNA Assay**
* Probe有分cancer transcriptome atlas (CTA)及whole transcriptome atlas (WTA)
**[==> 更多資訊關於Probe請點此連結](https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-rna-assays/)**
* 請估算選取的ROI數量以準備readout時所需採購的試劑量(實驗如需做segmentation，一個ROI=2~3AOI)
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**Protein assay**
* 請選取所需panel (core為必須的，module可任選搭配)
**[==> 更多資訊關於Panel請點此連結](https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-protein-assays/)**
* Protein assay的定量以盤為單位，建議設計實驗時以選取96AOI後再進行readout較好
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* 關於morphology marker的選擇，Nanostring原廠只出Panck和CD45的搭配，如需其他的morphology marker，可參考下方連結
**[==> GeoMx®Morphology Markers](https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-morphology-markers/)**，裡面有Nanostring實驗室有用過的morphology marker供使用者參考。

**3. 試劑到貨後會通知使用者並安排實驗日期**
* 請使用者在正式實驗前要完成教育訓練，完整的教育訓練包括**實驗技術及原理介紹**及**實驗操作**兩部份。實驗技術及原理介紹請自行點下方連結觀看學習，實驗操作則另外約時間進行。
* **[==> 實驗技術原理介紹請點此](https://www.dropbox.com/sh/td960x0a7uvwbyu/AABIc__4dSgK_GAivWknId6fa?dl=0)** : 請依照實驗類型分別選擇[protein-nCounter]或[RNA-NGS]的影片觀看學習

**4. 實驗操作**
* 實驗地點: 台大醫學院 基礎醫學大樓 1413室
* 所需設備及耗材等由1413準備，實驗結束後再依使用量計算應分擔的費用。

## 實驗所需金額
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**RNA assay** (完整實驗包括三筆費用，如下分述)

* **Nanostring原廠試劑**
--> 付費方式:訂購物品時會同時通知廠商與使用者，請雙方自行討論核銷事宜。
* **實驗時使用的其他試劑耗材或share的Nanostring原廠試劑及基本機器維護費用** (例如:上機用Instrument buffer,酒精, PBS, SSC, DEPC H2O, tip, 封膜...)
--> 按使用的數量分擔金額，實驗完成後結算並給與相對應金額的試劑耗材類發票，請使用者協助核銷該發票。
* **NGS定序費用**
--> 定序由13樓李慧瑛博士進行，完成後李博會給與發票以供報帳核銷。若自行外送定序也可。
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**Protein assay** (完整實驗包括二筆費用，如下分述)
* **Nanostring原廠試劑**
--> 付費方式:訂購物品時會同時通知廠商與使用者，請雙方自行討論核銷事宜。
* **實驗時使用的其他試劑耗材**(例如:酒精, PBS, SSC, DEPC H2O, tip, 封膜...)
--> 按使用的數量分擔金額，實驗完成後結算並給與相對應金額的試劑耗材類發票，請協助核銷該發票。
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## 實驗排程預估
**[==> 請按此取得Protocols for **RNA assay**](https://www.dropbox.com/sh/kzgtyiba6rtvpaf/AADBrYBI0Z56Z9IgnOgeB08ma?dl=0)**

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***RNA assay***
Day1: [Manual FFPE slide preparation] 染色 (下午)
Day2: [Manual FFPE slide preparation] 染色 (上午)
Day3: [Instrument] 上機 (也可於Day2染色後接著上機，上機準備至影像呈現 ~1.5-2 hr,ROI selection ~2-4 hr, barcode collection ~1-5 hr) (Barcode collection: 每24 AOI大約需1~1.5小時收集完成，請自行評估時間)
Day4: [Readout] Library (全天)
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**[==> 請按此取得Protocols for **Protein assay**](https://www.dropbox.com/sh/ox12jj46t69qzgr/AAAqwGuoLyBSyHKRrOq6Bxnta?dl=0)**
:::success
***Protein assay***
Day1: [Manual FFPE slide preparation] 染色 (下午)
Day2: [Manual FFPE slide preparation] 染色 (上午)
Day3: [Instrument] 上機 (也可於Day2染色後接著上機，上機準備至影像呈現 ~1.5-2 hr,ROI selection ~2-4 hr, barcode collection ~1-5 hr) (Barcode collection: 每24 AOI大約需1~1.5小時收集完成，請自行評估時間)
Day4: [Hybridization] (下午)
Day5: [MaxFlex system] nCounter + Analyzer
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