# Primer3によるPCRプライマー設計の自動化

Primer3web: https://bioinfo.ut.ee/primer3/

下記の配列を入力してデフォルトパラメータで設計：

GGGGAGGAGAAAAGTTTGAGCGGCTCGGTTGCCGGGAAGCCCCCGGGACGGCGCGCCGGCCGAGGGGGAATCTCGCCCCGGCAAGCAGTCCGCCCACAGGCTCTGCTTGCCCTTATCGGAGCCgcggggagcgggcgggcgggccggcgggTGCCGCCGCGGATTTGACTCCTGATTTCGGGGCCGTCTCTCTGCCTTGCAGATTAAGTACACGGGCTTCAGGGACCGGCCCCACGAGGAGCGCCAGACACGCTTCCAGAACGCCTGCCGCGACGGTCGCTCGGAGATCGTAAGTCGCCGGGGAGGGACCCCCCCACCCTACCCCCGGTGCGCGCGGGGAGGCCGCGGGGACCCAGGCGCGCGCCAGTCACTTGTTGCGCGCGGCCCCGGGCGTGTTCCGGACGGCGCCGCGGACGCTGCGGC

コマンド：

% curl -X POST https://bioinfo.ut.ee/cgi-bin/primer3/primer3web_results.cgi \
-F SEQUENCE_TEMPLATE=GGGGAGGAGAAAAGTTTGAGCGGCTCGGTTGCCGGGAAGCCCCCGGGACGGCGCGCCGGCCGAGGGGGAATCTCGCCCCGGCAAGCAGTCCGCCCACAGGCTCTGCTTGCCCTTATCGGAGCCgcggggagcgggcgggcgggccggcgggTGCCGCCGCGGATTTGACTCCTGATTTCGGGGCCGTCTCTCTGCCTTGCAGATTAAGTACACGGGCTTCAGGGACCGGCCCCACGAGGAGCGCCAGACACGCTTCCAGAACGCCTGCCGCGACGGTCGCTCGGAGATCGTAAGTCGCCGGGGAGGGACCCCCCCACCCTACCCCCGGTGCGCGCGGGGAGGCCGCGGGGACCCAGGCGCGCGCCAGTCACTTGTTGCGCGCGGCCCCGGGCGTGTTCCGGACGGCGCCGCGGACGCTGCGGC \
-F PRIMER_TASK=generic \
-F PRIMER_MASK_FAILURE_RATE=0.1 \
-F PRIMER_MASK_5P_DIRECTION=1 \
-F PRIMER_MASK_3P_DIRECTION=0 \
-F PRIMER_MISPRIMING_LIBRARY=NONE \
-F MUST_XLATE_PRIMER_PICK_LEFT_PRIMER=1 \
-F MUST_XLATE_PRIMER_PICK_RIGHT_PRIMER=1 \
-F Pick\ Primers=Pick\ Primers \
-F SEQUENCE_FORCE_LEFT_START=-1000000 \
-F SEQUENCE_FORCE_RIGHT_START=-1000000 \
-F SEQUENCE_FORCE_LEFT_END=-1000000 \
-F SEQUENCE_FORCE_RIGHT_END=-1000000 \
-F PRIMER_MIN_QUALITY=0 \
-F PRIMER_MIN_END_QUALITY=0 \
-F PRIMER_QUALITY_RANGE_MIN=0 \
-F PRIMER_QUALITY_RANGE_MAX=100 \
-F PRIMER_MIN_SIZE=18 \
-F PRIMER_OPT_SIZE=20 \
-F PRIMER_MAX_SIZE=23 \
-F PRIMER_MIN_TM=57.0 \
-F PRIMER_OPT_TM=59.0 \
-F PRIMER_MAX_TM=62.0 \
-F PRIMER_PAIR_MAX_DIFF_TM=5.0 \
-F PRIMER_TM_FORMULA=1 \
-F PRIMER_PRODUCT_MIN_TM=-1000000.0 \
-F PRIMER_PRODUCT_OPT_TM=0.0 \
-F PRIMER_PRODUCT_MAX_TM=1000000.0 \
-F PRIMER_MIN_GC=30.0 \
-F PRIMER_OPT_GC_PERCENT=50.0 \
-F PRIMER_MAX_GC=70.0 \
-F PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=150-250\ 100-300\ 301-400\ 401-500\ 501-600\ 601-700\ 701-850\ 851-1000 \
-F PRIMER_NUM_RETURN=5 \
-F PRIMER_MAX_END_STABILITY=9.0 \
-F PRIMER_MAX_LIBRARY_MISPRIMING=12.00 \
-F PRIMER_PAIR_MAX_LIBRARY_MISPRIMING=20.00 \
-F MUST_XLATE_PRIMER_THERMODYNAMIC_OLIGO_ALIGNMENT=1 \
-F PRIMER_MAX_SELF_ANY_TH=45.0 \
-F PRIMER_MAX_SELF_END_TH=35.0 \
-F PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_ANY_TH=45.0 \
-F PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_END_TH=35.0 \
-F PRIMER_MAX_HAIRPIN_TH=24.0 \
-F PRIMER_MAX_SELF_ANY=8.00 \
-F PRIMER_MAX_SELF_END=3.00 \
-F PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_ANY=8.00 \
-F PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_END=3.00 \
-F PRIMER_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=40.00 \
-F PRIMER_PAIR_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=70.00 \
-F PRIMER_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING=12.00 \
-F PRIMER_PAIR_MAX_TEMPLATE_MISPRIMING=24.00 \
-F PRIMER_MAX_NS_ACCEPTED=0 \
-F PRIMER_MAX_POLY_X=4 \
-F PRIMER_INSIDE_PENALTY=-1.0 \
-F PRIMER_OUTSIDE_PENALTY=0 \
-F PRIMER_FIRST_BASE_INDEX=1 \
-F PRIMER_GC_CLAMP=0 \
-F PRIMER_MAX_END_GC=5 \
-F PRIMER_MIN_LEFT_THREE_PRIME_DISTANCE=3 \
-F PRIMER_MIN_RIGHT_THREE_PRIME_DISTANCE=3 \
-F PRIMER_MIN_5_PRIME_OVERLAP_OF_JUNCTION=7 \
-F PRIMER_MIN_3_PRIME_OVERLAP_OF_JUNCTION=4 \
-F PRIMER_SALT_MONOVALENT=50.0 \
-F PRIMER_SALT_CORRECTIONS=1 \
-F PRIMER_SALT_DIVALENT=1.5 \
-F PRIMER_DNTP_CONC=0.6 \
-F PRIMER_DNA_CONC=50.0 \
-F PRIMER_SEQUENCING_SPACING=500 \
-F PRIMER_SEQUENCING_INTERVAL=250 \
-F PRIMER_SEQUENCING_LEAD=50 \
-F PRIMER_SEQUENCING_ACCURACY=20 \
-F MUST_XLATE_PRIMER_LIBERAL_BASE=1 \
-F MUST_XLATE_PRIMER_EXPLAIN_FLAG=1 \
-F PRIMER_WT_SIZE_LT=1.0 \
-F PRIMER_WT_SIZE_GT=1.0 \
-F PRIMER_WT_TM_LT=1.0 \
-F PRIMER_WT_TM_GT=1.0 \
-F PRIMER_WT_GC_PERCENT_LT=0.0 \
-F PRIMER_WT_GC_PERCENT_GT=0.0 \
-F PRIMER_WT_SELF_ANY_TH=0.0 \
-F PRIMER_WT_SELF_END_TH=0.0 \
-F PRIMER_WT_HAIRPIN_TH=0.0 \
-F PRIMER_WT_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=0.0 \
-F PRIMER_WT_SELF_ANY=0.0 \
-F PRIMER_WT_SELF_END=0.0 \
-F PRIMER_WT_TEMPLATE_MISPRIMING=0.0 \
-F PRIMER_WT_NUM_NS=0.0 \
-F PRIMER_WT_LIBRARY_MISPRIMING=0.0 \
-F PRIMER_WT_SEQ_QUAL=0.0 \
-F PRIMER_WT_END_QUAL=0.0 \
-F PRIMER_WT_POS_PENALTY=0.0 \
-F PRIMER_WT_END_STABILITY=0.0 \
-F PRIMER_WT_MASK_FAILURE_RATE=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_SIZE_LT=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_SIZE_GT=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_TM_LT=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_PRODUCT_TM_GT=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_COMPL_ANY_TH=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_COMPL_END_TH=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_TEMPLATE_MISPRIMING_TH=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_COMPL_ANY=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_COMPL_END=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_TEMPLATE_MISPRIMING=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_DIFF_TM=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_LIBRARY_MISPRIMING=0.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_PR_PENALTY=1.0 \
-F PRIMER_PAIR_WT_IO_PENALTY=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_MIN_SIZE=18 \
-F PRIMER_INTERNAL_OPT_SIZE=20 \
-F PRIMER_INTERNAL_MAX_SIZE=27 \
-F PRIMER_INTERNAL_MIN_TM=57.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_OPT_TM=60.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_MAX_TM=63.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_MIN_GC=20.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_OPT_GC_PERCENT=50.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_MAX_GC=80.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_MAX_SELF_ANY_TH=47.00 \
-F PRIMER_INTERNAL_MAX_SELF_END_TH=47.00 \
-F PRIMER_INTERNAL_MAX_HAIRPIN_TH=47.00 \
-F PRIMER_INTERNAL_MAX_SELF_ANY=12.00 \
-F PRIMER_INTERNAL_MAX_SELF_END=12.00 \
-F PRIMER_INTERNAL_MIN_QUALITY=0 \
-F PRIMER_INTERNAL_MAX_NS_ACCEPTED=0 \
-F PRIMER_INTERNAL_MAX_POLY_X=5 \
-F PRIMER_INTERNAL_MISHYB_LIBRARY=NONE \
-F PRIMER_INTERNAL_MAX_LIBRARY_MISHYB=12.00 \
-F PRIMER_INTERNAL_SALT_MONOVALENT=50.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_DNA_CONC=50.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_SALT_DIVALENT=1.5 \
-F PRIMER_INTERNAL_DNTP_CONC=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_SIZE_LT=1.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_SIZE_GT=1.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_TM_LT=1.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_TM_GT=1.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_GC_PERCENT_LT=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_GC_PERCENT_GT=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_SELF_ANY_TH=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_SELF_END_TH=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_HAIRPIN_TH=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_SELF_ANY=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_SELF_END=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_NUM_NS=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_LIBRARY_MISHYB=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_SEQ_QUAL=0.0 \
-F PRIMER_INTERNAL_WT_END_QUAL=0.0 \

→ ウェブと同じ結果が得られる。TXTやJSON形式の出力は用意されておらず、HTMLのみ。

-F PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=200-400 \
-F PRIMER_NUM_RETURN=1 \

に変更して実行、結果からプライマー配列を抜き出す。

% curl -X POST https://bioinfo.ut.ee/cgi-bin/primer3/primer3web_results.cgi \
...
-F PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=200-400 \
-F PRIMER_NUM_RETURN=1 \
...
  | grep -E '^(LEFT|RIGHT)\ PRIMER'

結果：

LEFT PRIMER          6   20   58.76   50.00    0.00   0.00    0.00 GGAGAAAAGTTTGAGCGGCT
RIGHT PRIMER       224   20   59.10   55.00    0.00   0.00    0.00 CCCTGAAGCCCGTGTACTTA

プライマー配列のみ出力

% curl -X POST https://bioinfo.ut.ee/cgi-bin/primer3/primer3web_results.cgi \
... \
-F PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=200-400 \
-F PRIMER_NUM_RETURN=1 \
... \
  | grep -E '^(LEFT|RIGHT)\ PRIMER' | sed 's/.*\ //'

結果：

GGAGAAAAGTTTGAGCGGCT
CCCTGAAGCCCGTGTACTTA