---
# System prepended metadata

title: Atividade Prática II – Filogenia dos Genes "16S rRNA" e "rpoB"
tags: [Misc]

---

# Atividade Prática II – Filogenia dos Genes "16S rRNA" e "rpoB"

###### tags: `Misc`

**Tutorial original:** [link](https://hackmd.io/@dgpinheiro/bioinfo2021-aval2)

[TOC]

## 1. Instalação dos Programas e preparação do ambiente

- Pacote com todos os programas (Caso baixe esse, não será necessário fazer o download de cada programa individualmente): [link](https://drive.google.com/file/d/1vKSgokrumlsylRcD9Q4MnDw2YMAdcXqb/view?usp=sharing)

### 1.1. Instalação do JAVA

- Faça o download do JAVA em sua versão "Windows Off-line (64 bits)": [link](https://www.java.com/pt-BR/download/manual.jsp)
- Faça a instalação de forma simples, abrindo o arquivo e clicando em "Instalar";

### 1.2. Instalação do UGENE

- Faça o download do UGENE na página: [link](https://github.com/ugeneunipro/ugene/releases/download/43.0/ugene-43.0-win-x86-64.exe)
- Faça a instalação de forma simples, sempre clicando em *"next", "agree", "install",* etc.

### 1.3. Instalação do "jmodeltest", "BEAST" e "FigTree"

- Baixe os programas nos links:
    - jmodeltest: [link](https://github.com/ddarriba/jmodeltest2/releases/download/v2.1.9r20160115/jmodeltest-2.1.9-win32.zip) 
    - BEAST: [link](https://www.beast2.org/download-windows/)
    - BEAGLE (complemento do BEAST): [link](https://github.com/beagle-dev/beagle-lib/releases/download/v3.1.0/BEAGLE.v3.1.0.msi)
    - FigTree: [link](https://github.com/rambaut/figtree/releases/download/v1.4.4/FigTree.v1.4.4.zip)
- Com exceção do "BEAGLE" (o qual deve ser instalado normalmente), os outros devem ser apenas extraídos por meio de um programa como "winzip" ou "winrar".

### 1.4. Crie os subdiretórios

- Na pasta de trabalho, crie duas subpastas chamadas **"seqs"** e **"aligns"** para armazenar as sequências e alinhamentos, respectivamente.

## 2. Obter seq. dos genes "16S rRNA" e "rpoB"

- No total serão necessários 5 genomas: 4 de bactérias de um determinado gênero e 1 pertencente à um grupo externo (Ex. mesma classe ou ordem, mas família diferente). 

- Para escolher o gênero e o grupo externo utilize o site do **NCBI Taxonomy** ([link](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy));
    - Procure por um gênero e então um grupo externo do mesmo filo, classe ou ordem...

- Uma vez escolhido os gêneros, procure pelos genomas em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/
    - Afim de selecionar apenas genomas completos e recentes, altere os filtros de completude e data:
    - *Ex.: Apenas genomas completos, depositados entre 2018 e 2022*
    ![](https://i.imgur.com/u4dAsrX.png)

- Abra o programa **UGENE**

- Copie o ID RefSeq do Genoma
    - ![](https://i.imgur.com/FJjwkqy.png)

- No **UGENE**, vá em "File" > "Search NCBI GenBank..."
    - Na nova janela, cole o ID RefSeq do genoma de interesse;
    - Dê um "Search" e, então, baixe o genoma selecionando-o e clicando em "Download" (PS: no caso de mais de um resultado, opte pelo cromossomo). Dê "Ok" sem alterar nada, e aguarde o download.

- Após baixado o genoma, clique na ferramenta de PCR *in silico*:
    - ![](https://i.imgur.com/W4TVuYb.png)

- Repita o processo a seguir (**obtenção de sequências**) para os seguintes pares de primer:
    - Primers para o gene *16S rRNA*. Tamanho de frag. esperado ~1445 bp:

        | ID       | Sequência 5'-3'      |
        | -------- | -------------------- |
        |   27F    | AGAGTTTGATYMTGGCTCAG |
        | 1492R    | TACCTTGTTACGACTT     |

    - Primers para o gene *rpoB*. Tamanho de frag. esperado ~434 bp:

        | ID               | Sequência 5'-3'           |
        | ---------------- | ------------------------- |
        | Univ_rpoB_F_deg  | GGYTWYGAAGTNCGHGACGTDCA   |
        | Univ_rpoB_R_deg  | TGACGYTGCATGTTBGMRCCCATMA |

- **Obtenção das sequências**
    - Insira os pares de primers de cada marcador, alterando os parametros de "Mismatches" para 2 bp e o "3' perfect match" para 0 bp;
    - ![](https://i.imgur.com/KvKUP81.png)
    - Clique em "Find product(s) anyway"
    - Dê um clique em um dos resultados (o marcador 16S pode ter mais de uma cópia. **LEIA O AVISO ABAIXO**). Note que um trecho do DNA foi selecionado.
    :::info
    - **Para o *gene 16S* note que poderá haver mais de um resultado. Nesse caso, selecione aquele cuja a fita 5'-3' (de cima) esteja em destaque.**
    - **Caso haja mistura de fitas 5'-3' e 3'-5' dos diferentes genomas, haverá problemas no alinhamento!** 
    
    - **Resultado no sentido 3' - 5' :-1:**
    ![](https://i.imgur.com/gteSSpF.png)
    
    - **Resultado no sentido 5' - 3' :+1:**
    ![](https://i.imgur.com/EIdIUP6.png)

    - Em caso de NÃO haver um resultado no sentido correto (5'-3'), selecione o resultado do sentido oposto, e então pressione as teclas **`ctrl` + `shift` + `R`**. Isso irá substituir a sequência selecionada pelo reverso-complementar e funcionará da mesma forma.
    
    :::

    - Com o resultado selecionado, clique em "Actions" > "Export" > "Export Selected Sequence Region". Na nova janela, indique o caminho para salvar na pasta "seqs". Salve com o padrão "Nomeespécie_marcador". *Ex.: Sphingomonas aerolata -> S_aerolata_16S.fa*
    - Retire a seleção de "Add document to the project";
    - Selecione a opção "Use custom sequence name" e altere o nome no mesmo padrão do nome do arquivos, **EXCETO QUE AQUI NÃO DEVE INCLUIR O MARCADOR (Ex. _16S ou _rpoB) JÁ QUE O MESMO DEVE SER COMPATÍVEL ENTRE AMBOS PARA POSSIBILITAR ANÁLISES FUTURAS**. Então, clique em "Export".
    ![](https://i.imgur.com/lzGaAQn.png)

- Repita o mesmo para o próximo par de primers e então vá para o próximo genoma (repita a extração dos marcadores para os 5).

## 3. Alinhamento múltiplo de sequências

:::info
**Repetir para cada conjunto de marcadores (todos de "16S rRNA" ou "rpoB")**
:::

- Abra o programa **UGENE**

- Clique em "File" > "Open..." e selecione todos os arquivos de um marcador (PS: pressione `ctrl` para selecionar múltiplos);
     ![](https://i.imgur.com/YubDYUC.png)

- Na nova janela, selecione a opção "Join sequences into alignment" e desabilite a opção de salvar documento ("Save document").
    ![](https://i.imgur.com/QqVCpAV.png)

- Realize o alinhamento, clicando em: "Actions" > "Align" > "Align with ClustalW..." > "Align"

- Por fim, salve o alinhamento no formato `fasta`, clicando com o lado direito do mouse sobre o objeto da sequência > "Export/Import" > "Export alignment to sequence format..."
    - ![](https://i.imgur.com/9MhmMjN.png)
    - Altere o nome de modo a informar o marcador e designar o local de saída para a pasta "align";
    - Remova a seleção de "Add document to the project"
    - Certifique-se de que a opção de manter os gaps esteja selecionada ("Keep") e, então, clique em "Export".
    ![](https://i.imgur.com/zm3yebW.png)

- Repita para o próximo conjunto de marcadores

## 4. Obtenção do modelo evolutivo

:::    warning
**CORREÇÃO (28/07/2022) - Problema com o "jModelTest"**
- Aparentemente, o programa "jModelTest" apresenta incompatibilidade com certos nomes de sequências. O problema parece estar relacionado com o tamanho do nome da primeira sequência do arquivo de alinhamento (ainda não temos 100% de certeza quanto a isso). 
- Para corrigir o problema, será necessário alterar os nomes das sequências presentes nos arquivos de alinhamentos de cada gene. 
- Inicie a correção, criando uma cópia do arquivo de cada alinhamento (**Essa cópia servirá somente para a execução do jModelTest, as outras análises serão feitas com o arquivo original do alinhamento**):
![](https://i.imgur.com/25D3Dbl.png =x120)
- Edite a cópia, clicando com o lado direito do mouse, então em "Abrir com" > "Bloco de notas" (se não aparecer de cara, clique em "Mais aplicativos")
![](https://i.imgur.com/6goZ7lg.png =x250)
- No arquivo, troque o **nome** de cada sequência por um número (de 1 a 5). Ex.: Se a primeira seq. chamar ***">Dberigensis"***, troque para ***">1"*** e assim por diante. Não se preocupe em guardar os nomes, pois esse arquivo de cópia só será utilizado para estabelecer o modelo que será usado posteriormente.
![](https://i.imgur.com/L2SuMxS.png)
- Salve o arquivo, repita para o alinhamento do próximo gene e utilize esses arquivos-cópia de alinhamento para a análise com o "jModelTest" 
:::

:::info
**Repetir para cada conjunto de marcadores (todos de "16S rRNA" ou "rpoB")**
:::

- Abra o arquivo "jModelTest.jar" que se encontra no interior da pasta extraída do "jmodeltest". 

- Abra o arquivo de alinhamento, clicando em "File" > "Load DNA alignment". Navegue até a pasta, se nada aparecer, altere a opção "Files of type" para "All Files" e selecione um dos alinhamentos.
:::danger
**EM CASO DE ERRO, LEMBRE-SE DE LER O QUADRO AMARELO NO ÍNICIO DESSE TÓPICO PARA CORRIGIR O PROBLEMA E SELECIONE A CÓPIA CORRIGIDA DOS ALINHAMENTOS PARA ESSA ÁNALISE!!**
:::
![](https://i.imgur.com/fp4zkOZ.png)

- Faça a análise clicando em "Analysis" > "Compute likelihood scores". Na janela nova, troque o "Base tree search" para "Best". Então, clique em "Compute Likelihods" e aguarde. 
    ![](https://i.imgur.com/YWi8hvV.png)

- Adicionalmente, faça as análises para o modelo BIC ("Analysis" > "Do BIC calculations..." aceitando as configurações prédefinidas) e AICc ("Analysis" > "Do AIC calculations..." selecionando a opção "Use AICc correction")
    ![](https://i.imgur.com/3EeHMns.png)
    
    ![](https://i.imgur.com/bvINUPz.png)

- Por fim, clique "Edit" > "Save console" e altere o final de ".console" para ".txt". Salve
    ![](https://i.imgur.com/O5JvMip.png)


- Feche o jModelTest e abra novamente. Repita para o próximo conjunto de marcadores

## 5. Análise filogenética

### 5.1. Preparação do BEAST

- Na pasta extraída do "BEAST", abra o executável "BEAUti.exe"

- Clique em "File" > "Template" > "StarBeast"

- Clique no simbolo de "+" (Canto inferior esquerdo) e selecione um dos alinhamentos (*caso tenha utilizado a cópia com o nome de seq. alterado no jModelTest, aqui deverá ser usado o arquivo de alinhamento original, ou seja, aquele com os nomes corretos - que representam os organismos das seqs.*). Na janela aberta, altere de "aminoacid" para "nucleotide". Repita o mesmo para o próximo alinhamento.
    ![](https://i.imgur.com/57W76jV.png)

- Selecione ambos segurando a tecla `shift`, então clique em "Link Clock Models".
    - Após isso, altere o primeiro nome sob a coluna "Clock Model" para "default". Note que automaticamente alterará a segunda linha. 
    - Simplifique os nomes sob a coluna "Site Model" e "Tree" para apenas "16S" e "rpoB", nos respectivos alinhamentos.
    ![](https://i.imgur.com/8Ajbgf9.png)

- Mude para a aba "Taxon sets" e altere os nomes sob a segunda coluna para o nome completo da espécie
    ![](https://i.imgur.com/T6madDu.png)

- Na aba "Site Model". Aqui será necessário um preenchimento **específico** de acordo com o modelo estabelecido pelo "jModelTest". E isso deve ser feito para cada alinhamento (16S e rpoB).
    - Abra os relatórios salvos do "jModelTest";
    - Navegue até o resultado do "CORRECTED AKAIKE INFORMATION CRITERION (AICc)" (pode procurar esse termo com `ctrl + f`) e observe o melhor modelo:
    ![](https://i.imgur.com/kJaXD6D.png)
    - No BEAST, confira se esse modelo é encontrado sob o menu de opções do "Subst Model". Caso não esteja, procure-o na tabela de conversão (https://justinbagley.rbind.io/2016/10/11/setting-dna-substitution-models-beast/).
    - Caso ainda assim não encontre o modelo, pule para o próximo na lista de modelos que se encontra logo abaixo do primeiro resultado. Ex. Meu próximo modelo válido, ou seja, presente na lista nativa ou convertida do BEAST é o *HKY* 
    ![](https://i.imgur.com/fR8LQUB.png)
    
    - Caso seja necessário, realize outros ajustes de acordo com o tutorial original (https://hackmd.io/@dgpinheiro/bioinfo2021-aval2)
    - Repita o processo para o próximo marcador.

- Na aba "Clock Model", mantenha as configurações ("Strict Clock" e "Clock.rate = 1.0")

- Na aba "Priors", certifique-se que esteja selecionado o "Yule Model" no primeiro parâmetro
    - Altere o "birthRate.t:Species" para `Log Normal`
    - Nessa mesma opção, clique na seta antes do nome e altere o parâmetro "M" para `4` (certifique-se que o parâmetro "S" esteja com `1.25`)
    ![](https://i.imgur.com/7M7ZAR2.png)
    - Da mesma forma, na opção "popMean" altere para `Log Normal`
    - Nessa mesma opção, clique na seta antes do nome e altere o parâmetro "M" para `-5` e o parâmetro "S" para `1.2`)
    ![](https://i.imgur.com/KA3TGjx.png)



- Na última aba ("MCMC"), mude o valor de "Pre Burnin" para **100**

- Salve as configurações, clicando em "File" > "Save" com um nome qualquer (Ex. 16S_rpob_settings.xml)

### 5.2. Execução do BEAST

- Na pasta extraída do "BEAST", abra o executável "BEAST.exe".

- Em "Choose File...", selecione o arquivo de configuração obtido anteriormente e execute a análise ("Run"). Aguarde o processamento. 

- Na pasta das configurações serão criadas três saídas principais: Uma árvore para o gene 16S (`16S.trees`), uma para o rpoB (`rpoB.trees`) e a terceira para as espécies (`species.trees`). 

![](https://i.imgur.com/Uh47Opt.png)

### 5.3. Extrair a melhor árvore

- Na pasta extraída do "BEAST", abra o executável "TreeAnnotator.exe".

- Aqui extrairemos a melhor árvore a partir de múltiplas possíveis árvores que se encontram nos arquivos gerados pelo BEAST

- **Repetir os passos a seguir para cada umas das (3) árvores.**
    - Alterar o descarte inicial ("Burnin percentage") para `10`%;
    - Selecionar a árvore alvo em "Input Tree File" > "Choose File..."
    - Selecionar o caminho e nome de saída em "Output File" > "Choose File...". Coloque o nome original + "\_calibrated", "\_adjusted" ou algo semelhante para indicar que trata-se da árvore corrigida
    - Feche e reabra o programa, então repita o processo para a próxima árvore. 
    ![](https://i.imgur.com/fqEyVQ7.png)

## 6. Visualização das árvores

### 6.1. Visualização no DensiTree

- Na pasta extraída do "BEAST", abra o executável "DensiTree.exe".

- Aqui visualizaremos as árvores não-calibradas, ou seja, o arquivo anterior ao processo do "TreeAnnotator". Dessa forma, teremos uma ideia das versões alternativas que foram estipuladas.

- Clique em "File" > "Load" e selecione uma das árvores.
    ![](https://i.imgur.com/D0fLwUf.png)

- Abra as próximas árvores. Há consenso entre os marcadores? 

### 6.2. Visualização no FigTree

- Primeiramente, crie um arquivo relacionando o nome das sequências com o nome da espécie, para que utilizemos o mesmo nas visualizações. 
    - Abra um bloco de notas vazio;
    - Crie duas colunas (separando pela tecla `tab`), uma chamada "taxa" e outra "fullname"
    - Então, preencha as próximas linhas com o nome conforme encontrado nos arquivos das sequências (Ex. "D_berigensis" abaixo de "taxa" e "Devosia berigensis" abaixo de "fullname", separados por um `tab`). Salve como "nomes" ou algo do tipo
    ![](https://i.imgur.com/IjTg27r.png)

- Na pasta extraída do "FigTree", abra o executável "FigTree.exe".

- Abra uma das árvores corrigidas (saída do "TreeAnnotator"), clicando em "File" > "Open..." 

- Na coluna de opções ao lado esquerdo, selecione a opção "Node Labels" e expanda as configurações dessa opção, clicando na setinha antes do nome.
    - Altere o parâmetro "Display" para "posterior" para indicar o valor de robustez do clado. 
    ![](https://i.imgur.com/72CATJm.png)
    
- Importe a tabela dos nomes, produzida anteriormente, clicando em "File" > "Import Annotations..."
    - Vá ao menu expandido da opção "Tip Labels" e altere o parâmetro "Display" para "fullname".
    - Aumente um pouco o tamanho do texto no parâmetro "Font Size"
    ![](https://i.imgur.com/1jXv9ZE.png)

- Outros parâmetros como tamanho e coloração das linhas e labels (nomes) podem ser alteradas nas diferentes opções do programa.

- A árvore pode ser salva em diversos formatos ao clicar em "File" > "Export PNG/PDF/etc..."

![](https://i.imgur.com/iudFR67.png)

- Repita o processo para as outras árvores e salve-as mantendo a nomenclatura a qual elas representam (16S, rpoB ou Species).

