###### tags: `fccps`,`gz`

# Протеомика (ГЗмозг: 2020)

Современные методы высокопроизводительной масс-спектрометрии позволяют производить детекцию изменений, происходящих на пост-трансляционном уровне, на уровне белка. В тех случаях, когда наблюдаемые эффекты не отражаются на уровне транскриптома (например, виды острого стресса), протеомика оказывается единственным высокопроизводительным методом, который доступен исследователю. К наиболее хорошо разработанной подгруппе протеомных методов можно отнести так называемую "скорострельную" тандемную (англ. "shutgun") масс-спектрометрию с "зависимым сканированием" (англ. "Data Dependent Acquisition"). "Скорострельная" МС подразумевает ионизацию электрораспылением, совмещенную с ВЭЖХ, на которую наносятся предварительно ферментно расщепленные (как правило, трипсином) белки. Подход, предполагающий анализ продуктов ферментативного расщепления протеома, называется подходом "снизу-вверх". "Зависимое сканирование" подразумевает, что на фрагментацию и снятие масс-спектра фрагментов (MS2) поступают не все ионы, а только те, что представлены на масс-спектре исходной смеси (MS1) наиболее крупными пиками. Описанная разновидность протеомики представляется на сегодняшний день наиболее оптимальной как с точки зрения цены приборов и реагентов, так и с точки зрения получаемой качественной и количественной информации о структуре протеома. Как следствие, этот вид протеомики сейчас является наиболее распространенным, а приборы, пригодные для такого метода, активно устанавливаются в центрах коллективного пользования по всему миру.

В дальнейшем, мы будем говорить о протеомике только в рамках этой описанной ее разновидности, не затрагивая другие, не менее интересные направления, такие как MALDI-микроскопия, протеомика "сверху-вниз" (top-down) или скорострельная протеомика с независимым сканированием (Data Independent Acquisition).

Любая масс-спектрометрия, и протеомика здесь не исключение, решает две основные задачи: идентификация молекул и измерение их концентрации. Протеомика способна идентифицировать следующие важные сущности:
* белок как таковой
* варианты белка (альтсплайс-изоформы, мутанты)
* пост-трансляционные модификации белка, включая ..
* состояние тиольных групп цистеинов
* гликозилы, гликаны, гликированные формы
* фосфорилирование групп
* убиквитинилирование (и мечение убиквитин-подобными белками)
* прочие модификации (пальмитоилирование, ацетилирование и др.)
* белок, взаимодействующий с исследуемым соединением

Поскольку после трипсинолиза в лизате образца оказывается много десятков, а то и сотен тысяч различных пептидов, разрешение их на одномерной хроматограмме оказывается недостаточным. Поэтому при анализе полного протеома существ с большим геномом (млекопитающих, высших растений) перед нанесением образца на LC/MS2 обычно проводят префракционирование на ВЭЖХ или в ПААГ (Nice, 2020). При исследованиях протеома "в глубину" префракционирование может принимать достаточно сложные формы (Heidrun et al, 2019). Если целью исследования является не весь протеом или если белков в протеоме немного (бактерия), можно обойтись без префракционирования. Зачастую исследователя интересует только конкретная часть протеома, например фосфорилированные группы белков, или состояния цистеинов, или гликозилированные группы. В этом случае образец может обогащаться путем аффинной хроматографии или преципитации/элюции на смоле или магнитных частицах. Такое обогащение может происходить на стадии белков или пептидов, и тогда в наносимой фракции оказываются только интересующие исследователя объекты. Очень распространены методы обогащения именно при профилировании вторичных модификаций: в главе (Ke et al., 2016) хорошо описан широкий спектр таких подходов.

Особенность протеомики состоит в том, что площадь под пиком выхода пептида на двухмерной хроматограмме (LC/MS) зависит от эффективности ионизации электрораспылением, которая, в свою очередь, является плохо предсказуемой величиной. В связи с этим, количественное определение пептидов против какого-то единого "пептидного стандарта" оказывается невозможным. Однако, количественному измерению поддаются относительные изменения в протеоме; здесь выделяется две основных стратегии: с использованием мечения стабильными изотопами (isotope labeling) и без него (label-free). Группа подходов "label-free" наименее затратна с точки зрения финансов, поскольку изотопно-меченые реагенты достаточно дороги в производстве. В то же время, использование изотопного мечения для ряда задач позволяет существенно снизить необходимое приборное время и человеческий труд. Кроме различий в ресурсах, данные подходы отличаются сферой применимости, поэтому рассмотрим их подробнее.

## Количественная протеомика без использования изотопных меток (Label-free quantification, LFQ)
Разделяют два вида label-free подходов:
(1) на основе идентифицированных во всем образце спектров фрагментации, связанных с каждым белком ("spectral counting");
(2) на основе величины LC/MS-пиков, соответствующим идентифицированным пептидам.
*Первый подход* является относительно простым с точки зрения анализа данных, однако он работает только на уровне белков, причем тех, которые представленны в образце несколькими пептидами. Он не может быть использован для квантификации отдельных пептидов, в том числе модифицированных. *Второй подход* более строгий: в рамках его каждому идентифицированному спектру фрагментации сопоставляется область на LC/MS-хроматограмме (extracted ion chromatogram, XIC). Таким образом, для каждого идентифицированного пептида вычисляется интенсивность по аналогии с площадью под пиком на обычной хроматограмме. Метод имеет множество реализаций в зависимости от алгоритма идентификации пиков на сложной двухмерной LC/MS-хроматограмме. Этот подход хорошо подходит как для квантификации отдельных пептидов, так и для оценки количества белков.

Согласно недавней сравнительной работе (Bubis et al., 2017) среди методов первой группы выделяется метод NSAF (Zybailov et al., 2006), а среди методов второй группы -- MaxLFQ (Cox et al., 2014). Отметим, что все методы LFQ с точки зрения пробоподготовки эквивалентны, а отличаются только на уровне работы с данными. Оценка количества вещества на основе любого label-free метода является относительной. В случае когда два измерения проведены в воспроизводимых условиях, отношение оценок, полученных в рамках этих методов, будет равно отношению истинных количеств вещества. Это позволяет планировать эксперименты по количественной протеомике без использования изотопных меток и внутреннего мультиплексирования, о чем пойдет речь ниже.

## Мечение стабильными изотопами (Labeling-based quantification)

Стратегии изотопного мечения основаны на внесении хроматографически и химически неразличимого стандарта, обеспечивающие одновременное попадание молекулы образца и молекулы стандарта в ионизатор и их эквивалентную ионизацию. Здесь имеется две стратегии: использование простых изотопных (ICPL, ICAT, mTRAQ) или изобарных (iTRAQ, TMT, iodoTMT) меток для химического мечения проб, и метаболическое мечение клеточных культур изотопно мечеными аминокислотами (SILAC). Вне зависимости от типа мечения, образцы, получившие метки смешиваются и наносятся на LC/MS2 ввиде одной пробы.

В самом простом (и самом древнем) случае (ICPL, ICAT, mTRAQ) мы имеем несколько меток, различающихся только изотопным составом. Более современные изобарные метки (ILQ, isobaric labels quantification) имеют одинаковую химическую структуру и одинаковую массу до фрагментации (Rauniyar, Yates, 2014). однако после фрагментации метка разрушается на балансировочную часть, прикрепленную к пептиду и так называемый *репортерный ион*, который отличается по массе. Современные реагенты 16-plex-TMT способны мультиплексировать 16 проб при условии, что прибор четко различает массы репортерных ионов с точностью до 0.006 Дальтон. Сама группа TMT может использоваться для обогащения на анти-TMT смоле, чтобы исключить из протеома немеченые пептиды. Сравнение изобарных и простых изотопных меток mTRAQ и iTRAQ, отличающихся только изотопами, указывает на преимущество использования именно изобарных вариантов (Mertins et al., 2012). Квантификация по изобарным меткам оказывается чувствительной к образованию гибридных спектров (когда два разных иона оказываются в одном селекторном окне на MS1 и отправляются на фрагментацию совместно). Бороться с этим помогает выбор пиков на спектре фрагментации, снятие с этих фрагментов MS3 и измерение соотношение репортерных ионов уже в нём (Ting et al., 2011; Navarrete-Perea et al., 2018). Этот вариант ILQ, очевидно, предъявляет к приборам дополнительные требования.

Наиболее "чистым" методом мечения является, бесспорно, метод SILAC, когда клетки кормят изотопно меченым лизином и аргинином. Однако SILAC подходит только для культур клеток и очевидно не подходит для протеомики образцов тканей. Сравнение label-free и label-based методов, проведенное в разные года (Li et al., 2011; Megger et al., 2014; Stepath et al., 2020) показывают приблизительно одинаковые результаты. Согласно этим исследованиям, LFQ стабильно всегда имеет более высокое покрытие, однако воспроизводимость количественных оценок между репликатами ниже, чем у label-based методов. Качество идентификации у SILAC выше, чем у протокола с изобарным мечением, но все равно ниже, чем в безмеченых образцах. В то же время, точность квантификации SILAC находится на уровне изобарных протоколов.

## Исследование тиол-протеома
Особую важность с точки зрения изучения последствий ишемии представляет протеомика вторичных модификаций, а именно -- редокс протеомика или, другими словами, профилирование тиол-протеома. В самом простом варианте данный вид протеомики нацелен на всестороннее сравнение окисленности различных цистеиновых остатков в протеоме между опытом и контролем, или же на получение значений о степени окисленности каждого цистеина в протеоме для образца. Раздельное измерений окисленных и восстановленных групп достигается за счет блокирования R-SH групп на стадии лизиса клеток одним из блокирующих реагентов (например N-этилмалеимид, йодоацетамид). Рассмотрим ниже некоторые варианты, использованные в ключевых работах по редокс-протеомике.

1. **Простое изотопное мечение.** Использование легкого и тяжелого йодоацетамида (IAA) позволяет заблокировать тиольные группы IAA-L, затем восстановить все неблокированные S-S связи, и заблокировать уже их при помощи IAA-H. Степень окисленности каждого идентифицированного цистеина можно определить по соотношению Pep-IAA-L : Pep-IAA-H (van der Reest et al., 2018). Такой подход потенциально позволяет определить окисленность каждого цистеина.
2. **Изотопное мечение с обогащением.** Использование так называемых ICAT (Isotope Coded Affinity Tags) предполагает схему, аналогичную пункту 1, но с использованием аффинных меток разной тяжести. Например, в работе по профилированию редокс-протеома нескольких клеточных линий в ответ на окислительный стресс (Fu et al., 2017) использовалась составная метка: йодоацетамид-алкин + изотопно меченый UV-расщепляемый биотин-азид. После предварительного обогащения на стрептавидин-сефарозе, образцы облучались ультрафиолетом. Такие подходы также потенциально позволяет определить окисленность каждого цистеина, однако в данном случае из пробы удаляются пептиды, не содержащие цистеинов вовсе, и это существенно улучшает качество идентификации на МС.
3. **Относительное измерение окисленных цистеинов с обогащением.** После блокирования свободных тиольных групп, и последующего восстановления DTT, пептиды могут быть обогащены за неблокированные группы либо на тиосефарозе (Guo et al., 2014), либо за биотиновую метку (Zaccarin et al., 2014). Последующая квантификация позволяет в итоге сравнить количество окисленных цистеинов в опыте и контроле. Данный метод подходит для кратковременных воздействий, когда общее количество белка принимается неизменным.
4. **Относительное измерение окисленных цистеинов с изотопными метками.** В качестве вариации 3-го метода: после блокирования и восстановления, окисленные группы могут быть сразу помечены при помощи изобарной метки iodoTMT (Su et al., 2019). Далее исследователь получает возможность с высокой точностью сравнить количество пептидов с окисленными цистеинами для некоторой серии образцов (например в серии воздействий различной силы).

Как мы видим, современные возможности мечения, блокирования и обогащения позволяют планировать самые разнообразные измерения состояния тиольных групп. В качестве примера более продвинутых современных исследований по редокс-протеомике, можно рассмотреть работу (Duan et al., 2020), где обогащение и изобарное мечение сочетаются с одновременным выделением фракции глутатионилированных групп из фракции окисленных групп.

# Литература

1. Fu, L. et al. Systematic and Quantitative Assessment of Hydrogen Peroxide Reactivity With Cysteines Across Human Proteomes. Mol. Cell. Proteomics 16, 1815–1828 (2017).
2. Su, Z. et al. Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt. Nat. Commun. 10, 5486 (2019).
3. Zaccarin, M. et al. Quantitative label-free redox proteomics of reversible cysteine oxidation in red blood cell membranes. Free Radic. Biol. Med. 71, 90–98 (2014).
4. Li, Z. et al. Systematic Comparison of Label-Free, Metabolic Labeling, and Isobaric Chemical Labeling for Quantitative Proteomics on LTQ Orbitrap Velos. J. Proteome Res. 11, 1582–1590 (2012).
5. Mertins, P. et al. iTRAQ Labeling is Superior to mTRAQ for Quantitative Global Proteomics and Phosphoproteomics. Mol. Cell. Proteomics 11, M111.014423 (2012).
6. Megger, D. A. et al. Comparison of label-free and label-based strategies for proteome analysis of hepatoma cell lines. Biochim. Biophys. Acta - Proteins Proteomics 1844, 967–976 (2014).
7. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P. & Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat. Methods 8, 937–940 (2011).
8. Muntel, J. et al. Comparison of Protein Quantification in a Complex Background by DIA and TMT Workflows with Fixed Instrument Time. J. Proteome Res. 18, 1340–1351 (2019).
9. Stepath, M. et al. Systematic Comparison of Label-Free, SILAC, and TMT Techniques to Study Early Adaption toward Inhibition of EGFR Signaling in the Colorectal Cancer Cell Line DiFi. J. Proteome Res. 19, 926–937 (2020).
10. Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P. & Paulo, J. A. Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3. J. Proteome Res. 17, 2226–2236 (2018).
11. Rauniyar, N. & Yates, J. R. Isobaric Labeling-Based Relative Quantification in Shotgun Proteomics. J. Proteome Res. 13, 5293–5309 (2014).
12. Levitsky, L. I. et al. IdentiPy: An Extensible Search Engine for Protein Identification in Shotgun Proteomics. J. Proteome Res. 17, 2249–2255 (2018).
13. Webb-Robertson, B. J. M. et al. Review, evaluation, and discussion of the challenges of missing value imputation for mass spectrometry-based label-free global proteomics. J. Proteome Res. 14, 1993–2001 (2015).
14. Matzke, M. M. et al. A comparative analysis of computational approaches to relative protein quantification using peptide peak intensities in label-free LC-MS proteomics experiments. Proteomics 13, 493–503 (2013).
15. Zybailov, B. et al. Statistical Analysis of Membrane Proteome Expression Changes in Saccharomyces c erevisiae. J. Proteome Res. 5, 2339–2347 (2006).
16. Rhode, H. et al. A next generation setup for pre-fractionation of non-denatured proteins reveals diverse albumin proteoforms each carrying several post-translational modifications. Sci. Rep. 9, 11733 (2019).
17. Cox, J. et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Mol. Cell. Proteomics 13, 2513–2526 (2014).
18. Nice, E. C. The separation sciences, the front end to proteomics: An historical perspective. Biomed. Chromatogr. (2020) doi:10.1002/bmc.4995.
19. Ke, M. et al. Identification, Quantification, and Site Localization of Protein Posttranslational Modifications via Mass Spectrometry-Based Proteomics. in 345–382 (2016). doi:10.1007/978-3-319-41448-5_17.
20. Duan, J. et al. Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations. Redox Biol. 36, 101649 (2020).
21. Araki, K. et al. Redox Sensitivities of Global Cellular Cysteine Residues under Reductive and Oxidative Stress. J. Proteome Res. 15, 2548–2559 (2016).
22. Guo, J. et al. Resin-Assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications. Nat. Protoc. 9, 64–75 (2014).
23. Van Der Reest, J., Lilla, S., Zheng, L., Zanivan, S. & Gottlieb, E. Proteome-wide analysis of cysteine oxidation reveals metabolic sensitivity to redox stress. Nat. Commun. 9, (2018).
24. Bubis, J. A., Levitsky, L. I., Ivanov, M. V., Tarasova, I. A. & Gorshkov, M. V. Comparative evaluation of label-free quantification methods for shotgun proteomics. Rapid Commun. Mass Spectrom. 31, 606–612 (2017).