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Máxima parcimônia no CIPRES
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## Conteúdo
[TOC]
## Arquivo de entrada no PAUP
Para realizar a análise de Máxima Parcimônia no CIPRES iremos utilizar a ferramenta PAUP e esse programa solicita como arquivo de dados o alinhamento no formato .nexus. Ao longo desse tutorial será citado referências teóricas para consulta no manual PAUP.

1. Converta o arquivo gerado pelo alinhamento (se você fez no MAFFT, o arquivo de saída deve ser .mafft) para **.nexus** (Isso pode ser feito no [ALTER](https://www.sing-group.org/ALTER/) ou Mesquite).

2. Para fazer a análise de parcimônia com réplicas no CIPRES é necessário informar o PAUP quais análises desejamos que sejam feitas. Assim, é necessário adicionar o **bloco de comando para o PAUP** no final do arquivo .nexus (semelhante ao que foi feito na prática de ML).

### Interpretação dos comandos básicos do PAUP para Máxima Parcimônia

**Comentários sobre cada linha serão feitos dentro de colchetes [!]**

[!Para indicar o começo do bloco de comandos:]
begin paup;

[!O arquivo "log" é uma boa maneira de guardar a saída geral de uma análise. O nome do arquivo log é designado depois de 'file=' e fica a escolha do usuario.Veja pag.76 do manual PAUP]
log start replace=yes file=FILENAME_log.txt;

[!Para fechar a janela depois que acabar a análise]
set autoclose=yes;

[!Para mudar o critério da análise para parcimônia]
set criterion=parsimony;

[!Para indicar o método de enraizamento]
set root=outgroup;

[!Para guardar o tamanho dos ramos]
set storebrlens=yes;

[!Acrescenta o número máximo de árvores encontradas para "aumentar automaticamente"; essa opção é interessante manter dessa maneira para buscarmos o máximo de árvores possíveis. O padrão do programa é somente a busca de 100 árvores]
set increase=auto;

[!Aqui você deve inserir os nomes dos grupos que você estabeleceu como grupo externo]
outgroup [Inserir o nome dos seus grupos externos separados por espaço];

[!Indica a análise de busca heurística (hs). Aqui a estratégia é encontrar o "ótimo global" evitando ficar preso em um "ótimo local". Outras opções são:  adição aleatória de sequências (addseq=random), o número de réplicas (nreps=) e o tipo de permuta de ramos (branch swapping). A opção limitperrep é usada se o conjunto de dados é muito grande e leva horas/dias por réplica de adição aleatória. Se a análise dos dados é muito rápida com a busca heurística, considere usar a busca branch and bound (bandb). Caso contrário, remova essa parte do comando.]
hsearch addseq=random nreps=[número de réplicas] [limitperrep=yes rearrlimit=5000 timelimit=5000] swap=tbr steepest=yes multrees=yes;

[!Describetrees é uma forma útil de gerar uma saída de texto das árvores com as estatísticas de árvore no arquivo log. Se apolist=yes, então as apomorfias por ramo são mostradas. Para mais detalhes, consulte pag. 60 do manual do PAUP disponível nas Referências desse tutorial]
describetrees 1/ root=outgroup plot=phylogram apolist=no;

[! Para salvar as árvores no arquivo que indicar (arquivo.tre) e ainda guardar os valores do tamanho dos ramos nas árvores.]
savetrees file=[nome do arquivo.tre] brlens=yes;

[! A análise de *bootstrap* gera uma medida de apoio dos clados gerados na árvore. Lembre-se de dar um nome informativo que fique fácil distinguir essa árvore de bootstrap das outras duas árvores de MP.]
bootstrap nreps=1000 search=heuristic/ addseq=random nreps=10 swap=tbr hold=1;
savetrees from=1 to=1 file=MyBootTree.tre format=altnex brlens=yes savebootp=NodeLabels MaxDecimals=0;

[!Para fechar bloco de comandos do PAUP]
end;

#### Cálculo dos tamanhos das árvores (tree length - tl), índices de retenção (ri), consistência (ci) e índice de consistência reescalonado (rc)

Para calcular os índices, basta adicionar a linha antes do final do bloco de comandos do PAUP, ou seja, antes do "end;". Para mais informações veja pag. 190 do manual PAUP.

pscores /tl ci ri rc;

#### Gerar uma árvore de consenso para as árvores mais parcimoniosas

Para gerar as árvores de consenso, basta adicionar a linha que indica os consensos de árvores no PAUP. Neste exemplo, eu solicitei ao programa PAUP que crie no arquivo *"myConsensustree.tre"* as árvores de regra de maioria _(majrule=yes)_ e consenso estrito _(strict=yes)_. Para mais informações veja pag. 214 do manual PAUP.

contree all / majrule=yes strict=yes treefile=myConsensustree.tre;

Copie e cole esse bloco de comandos no seu arquivo **Nexus** (depois de end;). Para isso, abra o arquivo **Nexus** em algum editor de textos (_Bloco de Notas_ ou o _WordPad_) e copiar o bloco de comandos e colar no final do arquivo. Aproveite para deletar do cabeçalho a linha _"symbols="ABCDEFGHIKLMNOPQRSTUVWXYZ""_.
Seu arquivo deverá ficar semelhante ao do exemplo abaixo:

#NEXUS
BEGIN DATA;
dimensions ntax=15 nchar=1059;
format missing=?
interleave datatype=NUCLEOTIDE gap=- match=.;

matrix
Gmargaretae  ATGACTGCAATTTTAGAGAGACGCGAAAGCGAAAACCTATGGGGCCGTTT
Pehlersiae   ATGACTGCAATTTTAGAGAGACGCGAAAGCGAAAGCCTGTGGGGCCGTTT
Sindicum     ATGACTGCAATTTTAGAGAGACGCGAAAGCGAAAGCCTATGGGGTCGCTT

(...) - o alinhamento continua ...


Gfiliformis  AATGTATAA
Gpygmaea     AATGTCTAA
Grepens      AATGTCTAA
Gtuberosa    AATGTCTAA
Gviolacea    AATGTATAA

;
end;
begin paup;
log start replace=yes file=FILENAME_log.txt;
set autoclose=yes;
set criterion=parsimony;
set root=outgroup;
set storebrlens=yes;
set increase=auto;
outgroup Taxa_do_OutGroup;
hsearch addseq=random nreps=100 swap=tbr steepest=yes multrees=yes;
savetrees file=NOME_MP.tre brlens=yes;
pscores /tl ci ri rc;
contree all / majrule=yes strict=yes treefile=myConsensustree.tre;
end;

Você poderá copiar e colar os comandos acima, contudo deverá **mudar pelo menos** as seguintes opções: **_outgroup_, _nreps=_, _file=_ e _treefile=_**.

## Como submeter a análise no CIPRES com o uso do PAUP com blocos de comandos
1. Suba o arquivo do alinhamento (convertido para .nexus e com o bloco de comando do PAUP) para a pasta **DATA**
2. Clique em **Tasks** > **Create a new task** e dê um nome para a tarefa *(p.ex. MP_cupins)*.
3. Clique em **Input** e selecione o arquivo recém convertido **.nexus**.
4. Clique em **Select Tools** e selecione **PAUP on XSEDE**.

5. Após realizar essa operação, precisamos informar para o programa **PAUP** que iremos usar o bloco de comandos que colocamos no arquivo **NEXUS**. Primeiro devemos clicar no botão **Parameters Set**

6. Abrirá a janela com as opções de parâmetros. Nessa janela, em **Maximum Hours to Run** insira o valor de 100; clique na caixa ao lado de **My data set has commands in a PAUP block** e selecione o critério de busca que quer realizar em **"Set the Optimality Criterion"** (selecione Parcimony)


8. Clique em **Save Parameters**.
9. Após isso, a tela irá retornar para a página de tarefas **Tasks** e então você poderá submeter a sua análise em **"Save and Run Task"**.
*Ps.: Lembre-se que ás vezes a **Description** some... Bug do sistema... Se sumir, escreva novamente o nome da análise que quer submeter.*

## Interpretação dos resultados do PAUP para Máxima Parcimônia

Após a conclusão da análise você receberá um e-mail avisando a conclusão. Acesse o CIPRES e clique em **View Output** ao lado da tarefa concluída. A nova janela que abrirá será semelhante a do exemplo abaixo:


Os seus arquivos mais importantes são o arquivo da árvore, chamado no exemplo de **COI_cupim_MP.tre**, o arquivo das árvores de consenso, **myConsensus_COIMP.tre**, e o arquivo da árvore de Bootstrap, **COI_BootTree.tre**, além do **STDOUT**, que traz todas as informações da análise, como os índices de retenção (RI), consistência (CI) e consistência reescalonado (RC), número de caracteres informativos, comprimento da árvore, etc...


Faça o download de todos os arquivos e abra o STDOUT em um bloco de notas e as árvores algum editor de árvores filogenéticas como [FigTree](http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) e [TreeGraph](http://treegraph.bioinfweb.info/) para fazer as modificações necessárias.

## Referências
Para uma discussão sobre a teoria de Máxima Parcimônia, árvore consenso, as estatísticas de árvore, conculte o manual do [PAUP](http://phylosolutions.com/paup-documentation/paupmanual.pdf) ou [site de ajuda do PAUP](https://paup.phylosolutions.com/). Para revisar os índice de retenção e consistência, consulte o livro Fundamentos de Sistemática Filogenética ou o [capítulo de MP do Phylogenetic Handbook].

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