<style> .remark-inline-code { background: #F8F8F8; border-radius: 3px; padding: 3px; } kbd { font-size: 18px; } img { display: block; margin-left: auto; margin-right: auto; } .inline img { display: inline; } pre { overflow-x: scroll; overflow-y: scroll; } </style> ```{r setup, include=FALSE} library(knitr) knitr::opts_chunk$set(cache=FALSE, warning=FALSE, message=FALSE, echo=TRUE, dpi=180, fig.path = 'figure/', fig.show = 'hold', fig.width=8, fig.align = 'center') #fig.asp=9/16 ggplot2::theme_set(ggplot2::theme_light()) ``` ## Kaynak Bu eğitimdeki içerik "[Reference-based RNA-Seq data analysis](https://training.galaxyproject.org/training-material/topics/transcriptomics/tutorials/ref-based/tutorial.html)" başlıklı eğitimden uyarlanmıştır. --- ## Yeni Nesil Dizileme - çoğaltma  .footnote[ Metzker, M. Sequencing technologies — the next generation. *Nat Rev Genet* 11, 31–46 (2010). https://doi.org/10.1038/nrg2626 ] --- ## Yeni Nesil Dizileme - sentez  --- ## Yeni Nesil Dizileme - okuma  --- ## Yeni Nesil Dizileme - kaynak Ek videolar * [Illumina 1](https://www.youtube.com/watch?v=77r5p8IBwJk) * [Illumina 2](https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM) --- ## Ham veri - Fastq formatı  --- ## Linux vs Windows  .footnote[image source: [Soshace.com](https://soshace.com/operating-systems-showdown-windows-vs-macos-vs-linux-for-web-development/)] --- # **Galaxy** Galaxy sunucularının tool içerikleri farklılık gösterebilir. Bu nedenle analizlerde kullanılacak olan tool'ların hangi sunucularda bulunduğuna göre Galaxy oturumu oluşturulmalıdır. <img style="float: right;" align="right" width="200" height="200" src="https://galaxyproject.eu/assets/media/galaxy-eu-logo.512.png"> Örneğin; [usegalaxy.org](https://usegalaxy.org/) docking için kullanılan *openbabel* tool'ları olmadığı için hata mesajı oluşturmaktadır. Bu nedenle [usegalaxy.eu](https://usegalaxy.eu/) veya diğer uygun sunucuların kullanılması gerekir. - 2500'den fazla tool, - Ücretsiz üyelik - 250 GB alan --- # RNA-SEQ analysis   :::spoiler [reference](https://bioinformatics.uconn.edu/reference-based-rna-seq-data-analysis/#) ::: --- # RNA-SEQ analysis ## I- Ham veriden okuma sayısının belirlenmesi ---- :::info 1. Yeni 'History' oluşturma 2. FASTQ Listelerinin Ortama Yüklenmesi 3. FASTQ Verisini Ortama Yüklenmesi (Faster Download and Extract Reads in FASTQ) 4. Birincil Dizi Kalite Kontrolü (FASTQC) 5. Birincil Veri Prosesi (Cutadapt) 6. Referans Genomun Yüklenmesi (*Drosophila melanogaster*, BDGP6.87.gtf, dm6) 7. Haritalama-Mapping (RNA STAR) 8. Haritalama-Mapping Görüntüleme 9. Gen Okuma Sayısının Tespiti ::: ---- ### RNA-Seq Verisinin Özellikleri GEO ([Gene Expression Omnibus](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)) Accession: **GSE18508** - **GSE18508** *Drosophila melanogaster* hücre hatlarında RNA Binding Proteinlerin (RBPs) araştırılması için 121 örnekli bir veri setidir. - 115 örnekte *farklı RBP'lerin depletion* deneyleri sonrasında *Illumina Genome Analyzer II* kullanılarak RNA-Seq ham verisi oluşturulmuştur. 6 örnekten oluşan kontrol grubu da aynı dizilemeye tabi tutulmuştur. Bu eğitimde, 121 örneğin iki tanesinin (GSM461176 vs GSM461179) 3 tekrarlı veri setleri kullanılarak ham veriden okuma sayısı elde edilme yöntemleri uygulanacaktır. | GSM461176 (untreated) | GSM461179 (RNAi) | | --------- | --------- | | SRR031708 | SRR031720 | | SRR031712 | SRR031721 | | SRR031713 | SRR031722 | - GSM461176 (single reads, untreated) - GSM461179 (single reads, *CG8144_RNAi* treated) --- ### 1. Yeni 'History' Oluşturma  --- ### 2. FASTQ Listelerinin Ortama Yüklenmesi Ham RNA-Seq datalarının Galaxy ortamına yüklenmesi, **Upload Data**, **Faster Download and Extract Reads in FASTQ** gibi tool'larla sağlanabilir. RNA-Seq ham verisinin öncelikle tanımlanması gerekir: :::success * **Upload Data** seçilir. * Paste/Fetch data opsiyonu kullanılır. * "Download data from the web by entering URLs (one per line) or directly paste content.": SRR erişim numaraları yazılır. * "Type": **Tabular** olarak belirtilir * Tabular verinin yüklenmesi **Start** ile başlatılır ve kapatılır. * Oluşturulan Tabular veri, History penceresinde görüntülenir. Veri ismi **Edit attributes** (Kalem ikonu) kullanılarak örnek ismi ile değiştirilir. ::: Örneğin resimde **GSM461176** örneğinin üç veri setinin SRR proje erişim numaraları *tabular* veri olarak eklenmiş ve veri seti **GSM461176_untreated** tanımlanmıştır.  ---- ### 3. FASTQ Verisinin Ortama Yüklenmesi :::success * **Faster Download and Extract Reads in FASTQ** tool'u seçilir. * **select input type**: *List of SRA accession, one per line* opsiyonu işaretlenir. * **sra accession list**: arama çubuğunun sağ tarafındaki dosya simgesinden önceki basamakta oluşturulan *tabular* veriler seçilir (**GSM461176_untreated** veya **GSM461179_treated**) ve onaylanır. * Diğer tüm opsiyonlar *default* ayarında bırakılır. :::  **NOT: Veri yükleme işlemi dört tip çıktı oluşturmaktadır:** 1. Pair-end data (fasterq-dump) 2. Single-end data (fasterq-dump) 3. Other data 4. fasterq-dump log Çıktı dosyalarının hedef veri setiyle uyumluluğu bu dosyalar kullanılarak onaylanabilir. Örneğin, bu eğitimde 3 single reads verisi girdi olarak kullanılmıştır. **Single-end data** ve **fasterq-dump log** dosyarıyla verinin doğruluğu kontrol edilebilir. Aynı işlem iki grup için de yapılmalıdır. Bu işlem sonrasında *fastqsanger.gz* dosyalarının ayrı ayrı isimlendirilmesi sonraki basamaklarda faydalı olacaktır. :::success | SRA proje numarası | Veri ismi | | -------- | -------- | | SRR031708 |GSM461176_untreated_1| | SRR031712 |GSM461176_untreated_2| | SRR031713 |GSM461176_untreated_3| | SRR031720 |GSM461179_treated_1| | SRR031721 |GSM461179_treated_2| | SRR031722 |GSM461179_treated_3| ::: Veri yükleme işlemleri bittiğinde dosyalarınızın özelliklerini ve her veri setinin *fastqsanger.gz* veri tipinde olduğunu kontrol etmeyi unutmayınız. --- ### 4. Dizi Kalite Kontrolü (FastQC) :::success * **FastQC** (Read Quality reports) tool'u aranır ve seçilir. * **Raw read data from your current history** opsiyonu için **Multiple datasets** butonu kullanılır. * Tüm **fastqsanger.gz** veri setleri seçilerek onaylanır ve tüm ayarlar *default* bırakılarak çalıştırılır. :::  FastQC tool'u her veri seti için iki tip çıktı oluşturmaktadır: 1. **RawData**  2. **Webpage**  *NOT*: Resimler **GSM461179_treated_1** (SRR031720) olarak tanımlanmış veri setinin kalite raporunu göstermektedir. --- ### 5. Birincil Veri Prosesi (Cutadapt) :::success * **Cutadapt** (Remove adapter sequences from FASTQ/FASTA) tool'u aranır ve seçilir. * **Single-end or Paired-end reads**: *Single-end* * **FASTQ/A file** opsiyonu için **Multiple datasets** butonu kullanılır. * Tüm **fastqsanger.gz** veri setleri seçilerek onaylanır. * **Filter Options** argümanlarında **Minimum length (R1)** "20" belirlenir. * **Read Modification Options** argümanlarında **Quality cutoff** "20" belirlenir. * **Output selector** bölümünde **Report: Cutadapt's per-adapter statistics. You can use this file with MultiQC.** çıktı dosyası işaretlenir. * Geriye kalan tüm argümanlar *default* bırakılarak çalıştırılır. :::  **Cutadapt** tool'u her bir fasqsanger.gz dosyası için iki dosya çıktısı oluşturur: 1. Report: İşin çalıştırma koşulları hakkında detay içerir. 2. Read 1 Output: Kaliteli okuma bulunan dizileri içeren **fastqsanger.gz** dosyasıdır. :::info **Opsiyonel:** Elde edilen **fastsanger.gz** dosyaları yeniden **FastQC** ile analiz edilerek yeni okuma dosyalarının kalitesi değerlendirilebilir. ::: Tüm veri setlerinde Cutadapt tool'u çalıştıktan sonra tüm veri setlerinin **Trimmed-** olarak (ya da alternatif bir etiketle) adlandırılması önerilir. Sonraki analizlerde işlem takibini kolaylaştıracaktır. | Veri ismi | Cutadapt sonrası çıktı ismi | | --------------------- | ------------------- | | GSM461176_untreated_1 | Trimmed_untreated_1 | | GSM461176_untreated_2 | Trimmed_untreated_2 | | GSM461176_untreated_3 | Trimmed_untreated_3 | | GSM461179_treated_1 | Trimmed_treated_1 | | GSM461179_treated_2 | Trimmed_treated_2 | | GSM461179_treated_3 | Trimmed_treated_3 | --- ### 6. Referans Genomun Ortama Yüklenmesi Bu eğitimde kullanılan organizma *Drosophila melanogaster*'dir. Fastqsanger.gz dosyalarının referans genom kullanılarak haritalanması (mapping) için öncelikle organizma referans genomunun **(*Drosophila melanogaster*)** galaxy ortamına tanımlanması gerekir. :::success * **Upload Data** tool'u seçilir. * Paste/Fetch data opsiyonu kullanılır. * "Download data from the web by entering URLs (one per line) or directly paste content.": Referans genom linki eklenir. * İşlem başlatılır ve onaylanır. * **NOT:** Veri yüklemesi bittikten sonra veri tipinin **gtf** olmasına dikkat edilmelidir. Kontrol etmek için **History** sekmesinde bulunan veri setinin üzerindeki **Edit attributes** opsiyonu kullanılır. ::: :::info *Drosophila melanogaster* referans genom verisi: https://zenodo.org/record/4541751/files/Drosophila_melanogaster.BDGP6.87.gtf :::  --- ### 7. Haritalama-Mapping (RNA STAR) :::success * **RNA STAR** tool'u aranır ve seçilir. * **Single-end or paired-end reads** Single-end olarak seçilir. * **RNA-Seq FASTQ/FASTA file** bölümünde **Multiple datasets** opsiyonuyla önceki basamakta "Trimmed-" olarak etiketlenen tüm **fastqsanger.gz** veri setleri seçilir. * **Custom or built-in reference genome**: *Use a built-in index* * **Reference genome with or without an annotation**: *use genome reference without builtin gene-model* * **Select reference genome**: *Fly (Drosophila Melanogaster): dm6 Full* * **Gene model (gff3,gtf) file for splice junctions**: *Drosophila_melanogaster.BDGP6.87.gtf* * **Length of the genomic sequence around annotated junctions**: "44" (Okuma uzunluğu -1) * Diğer tüm opsiyonlar *default* ayarında bırakılarak çalıştırılır. :::  RNA STAR tool'u her bir veri seti için üç farklı çıktı dosyası oluşmaktadır: 1. **log**  3. **splice junctions.bed**  4. **mapped.bam**  --- ### 8. Haritalama-Mapping Görüntüleme <img style="float: right;" align="right" width="120" height="190" src="https://i.imgur.com/Z116Sq0.png"> Mapped.bam dosyalarının görüntülenmesi için galaxy farklı opsiyonlar sağlamaktadır: - display at UCSC ++main++ - display with IGV ++local++ ++D. melanogaster++ - display in IGV ++view++ - display at bam.oibio ++bam.iobio.io++ UCSC main opsiyonu ile dosyayı görüntüleyelim.  --- ### 9. Gen Okuma Sayısının Tespiti :::success * **featureCounts** tool'u aranır ve seçilir. * **Alignment file** bölümünde **Multiple datasets** opsiyonuyla önceki basamakta çıktı olarak verilen tüm **mapped.bam** veri setleri seçilir. * **Specify strand information**: *Unstranded* * **Gene annotation file**: *in your history* * **Gene annotation file**: *Drosophila_melanogaster.BDGP6.87.gtf* * **Output format**: *Gene-ID "\t" read-count (MultiQC/DESeq2/edgeR/limma-voom compatible)* * **Create gene-length file**: *Yes* **Advanced options** bölümünde: * **Allow read to map to multiple features**: default * **Minimum mapping quality per read**: "10" Diğer tüm opsiyonlar *default* ayarında bırakılarak çalıştırılır. :::  featureCounts tool'u her **mapped.bam** veri seti için üç çıktı dosyası verir: 1. Feature lengths  3. Summary  5. Counts  **NOT**: Farklılaşmış gen ifade analizi için çıktı dosyalarının isimlendirilmesi önemlidir. Örneğin;  --- # RNA-SEQ analysis ## II- DESeq Analizi - Fenotipik düzeydeki farklılıkların (hasta vs sağlıklı) moleküler düzeyde anlaşılması - Biyobelirteç saptanması - Terapötik hedeflerin belirlenmesi - Teşhis için spesifik gen ifadesi patternlerinin belirlenmesi | Yöntem | Normalizasyon | Okuma Sayısı Dağılımı | Farklılaşmış ifade testi | | -------- | -------- | --- | -------- | |edgeR| TMM | Negatif Binomial Dağılım |Exact test| |DESeq|DESeq sizeFactor| Negatif Binomial Dağılım |Exact test| |Limma|TMM|Voom dağılımı | Emprical Bayes | | Cutdiff2| DESeq benzeri normalizasyon |Beta negatif Binomial Dağılım| t-test| --- :::info 1. Yeni 'History' Oluşturma 2. RNASeq_analysis History'sinden Ortama Veri Aktarma 3. DESeq2 4. İstatistiksel Olarak Anlamlı Düzeyde İfadesi Değişen Genleri Seçme 5. DE Genlerin Anotasyonu 6. Görüntüleme ::: --- ### 1. Yeni 'History' Oluşturma  --- ### 2. RNASeq_analysis History'sinden Ortama Veri Aktarma Bir galaxy kullanıcısının, iş akışları arasında veri seti taşıması mümkündür. :::success * History bölümünde **History options** ikonu seçilir. * **Dataset actions** seçeneklerinden **Copy Datasets** opsiyonu seçilir. * Açılan pencereden hangi history'ler arasında veri seti transferi yapılacağı seçilir. Örneğin resimler **Source History: RNASeq_analysis** -> **Destination History: DEG_analysis** gösterilmektedir. * Source History'de bulunan veri setleri pencerenin altında görünmektedir. Aktarılmak istenen veri setleri seçilerek bulunan ortama aktarılabilir. :::  Not: Eğitimin önceki bölümünde **featureCounts** tool'u kullanılarak elde edilen **:Counts** ve **:Feature lengths** uzantılı gen okuma dosyaları ve referans genomun DEG_analysis ortamına yüklenmesi gerekir. Yükleme işlemi tamamlandığında aşağıdaki uyarı görülecektir. :::warning 13 datasets copied to 1 history: **DEG_analysis.** ::: --- ### 3. DESeq2 :::success * **DESeq2** aranır ve seçilir. - **how** : *Select datasets per level* - **Factor**: - **Specify a factor name**: *RNAi_treatment_experiment* - 1: Factor level: - **Specify a factor level**: *Untreated* - Counts file(s): 3 kontrol örneği (_untreated_):Counts dosyaları - 2: Factor level: - **Specify a factor level**: *Treated* - Counts file(s): Diğer 3 örnek (_treated_):Counts dosyaları - **Files have header?**: Yes - **Choice of Input data**: *Count data* - **Output options**: - Output selector: *Generate plots for visualizing the analysis results* ve *Output normalised counts* Bu opsiyonlar ayarlandıktan sonra tool çalıştırılır. ::: Not: RNASeq_analysis bölümünde featureCounts tool'unda üretilen counts verileri ilk satırında başlıkları içermektedir. Bu nedenle **Files have header?** opsiyonu "Yes" olarak girilmelidir. DESeq2 işlemi üç çıktı dosyası oluşturur: 1. DESeq2 result file  2. Normalized counts file  3. DESeq2 plots Bu dosya girdi verilerinden yapılan analizlerin sonuçlarının istatistiksel sunumunu sağlayan .pdf uzantılı bir dosyadır. İçerik: Principle Component Analysis for RNAi_treatment_experiment, "Sample−to−sample distances", "Dispersion estimates", "Histogram of p−values for RNAi_treatment_experiment: Untreated vs Treated", "MA−plot for RNAi_treatment_experiment: Untreated vs Treated" --- ### 4. İstatistiksel Olarak Anlamlı Düzeyde İfadesi Değişen Genleri Seçme Farklılaşmış gen ifade (diferansiyel gen ekspresyonu, Differential Gene Expression, DEG) analizleri için, örneklerden ifadesi anlamlı düzeyde değişen genlerin tespitinde sonuç dosyasındaki iki temel parametre kullanılır: p-value ve log2(FC). - p-value (adj) < 0.05 - log2(FC) > |1| , abs(log2(FC)) > 1 NOT: Literatürde, araştırmanın kapsamına göre log2(FC) için farklı kabullerin görülmesi mümkündür. :::success - **Filter** tool'u aranır ve seçilir. - **Filter** girdi dosyası *DESeq2 result file* olarak belirlenir. - **With following condition**: p-adj için (7. sütun) *c7<0.05* belirtilir. - Çalıştırılır ve çıktı dosyasının adı **Edit attributes** menüsü ile *Genes with significant adj p-value* olarak değiştirilir. :::  :::success - **Filter** tool'u aranır ve seçilir. - **Filter** girdi dosyası *Genes with significant adj p-value* olarak belirlenir. - **With following condition**: log2(FC) için (3. sütun) *abs(c3)>1* belirtilir. - Çalıştırılır ve çıktı dosyasının adı **Edit attributes** menüsü ile *log_and_p_value_filtered_genes* olarak değiştirilir. :::  **Bu eğitimdeki iş akışını aynı şartları kullanarak yaptığınız takdirde CG8144_RNAi RBP varlığında 147 genin ifadesinde değişiklik olduğu görülecektir.** --- ### 5. DE Genlerin Anotasyonu :::success - **Annotate DESeq2/DEXSeq output tables** tool'u aranır. - **Tabular output of DESeq2/edgeR/limma/DEXSeq**, *log_and_p_value_filtered_genes* seçilir. - **Input file type**, *DESeq2/edgeR/limma* belirlenir. - Referans genom ise, *Drosophila_melanogaster.BDGP6.87.gtf* olarak seçilir. - Çalıştırılır ve *Annotated_degs* olarak isimlendirilir. :::  Oluşan veri setinin başlıkları bulunmamaktadır. Bunun için galaxy'nin farklı araçları kullanılabilir.  :::success - **Upload Data** seçilir. - **Paste/Fetch data** seçilir ve aşağıdaki başlıklar kopyalanıp yapıştırılabilir. - **Name** seçeneğinden isimlendirilir (*headers*) ve veri tipi *tabular* belirlenir. - Veri yüklemesi başlatılır ve pencere kapatılır. ::: GeneID Base mean log2(FC) StdErr Wald-Stats P-value P-adj Chromosome Start End Strand Feature Gene name  Anotasyon ile elde edilen veri setinin başlık (headers) verisiyle alt alta eklenmesi gerekir. :::success - **Concatenate datasets** (tail-to-head) tool'u aranır. - **Concatenate Dataset** *headers* - **Dataset**, *Insert Dataset* ile *Annotated_degs* veri seti seçilir ve çalıştırılır. - Veri seti **Edit attributes** opsiyonu ile yeniden isimlendirilir: *Annotated_degs_2* - Veri tipinin *tabular* olduğu **Edit attributes** menüsü ile kontrol edilir. ::: --- ### 6. Görüntüleme #### 6.1. Veri Setlerinin Hazırlanması DEG analizi sonucunda analizlerin daha anlaşılır olması için çeşitli görüntüleme yöntemleri kullanılabilir. Bunun için ilk basamak uygun veri setlerinin derlenmesidir :::success Normalize okuma verisi ve anotasyon verisinin birinci sütunları kullanılarak birleştirilmesi - **Join two Datasets** tool'u seçilir. - **Join**, *Normalized counts file*, using column = 1 - **with**, *Annotated_degs_2* and columnn = 1 - **Keep the header lines**, *Yes* - Diğer tüm opsiyonlar *default* ayarında bırakılır ve çalıştırılır. :::  :::success - **cut** tool'u seçilir. - **Cut colunmns**, *c1-c7* - **From**, en son birleştirilen veriseti - Çalıştırılır ve çıktı veri seti *Normalized_counts_DEGs* olarak değiştirilir. :::  Çıktı dosyasının görünümü:  #### 6.2. Görüntüleme ##### Heatmap :::success - **heatmap2** tool'u aranır. - Girdi dosyası *Normalized_counts_DEGs* seçilir. - İstenilen bir başlık belirlenir (örneğin, *DEGs-RNAi Treatment*). - **Data transformation**, *Log2(value+1) transform my data* seçilir. - **Enable data clustering**, *Yes* - **Labeling columns and rows**, *Label columns and not rows* - **Coloring groups**, *Blue to white to red* - Çalıştırılır. :::  Çıktı Grafiği:  ##### Z-score Heatmap Z-score bulunması için **Table Compute** tool'unda hesaplama yapılması gerekmektedir. :::success - **Table Compute** tool’u aranır. - **Input Single or Multiple Tables**: *Single Table* - **Table**: *Normalized_counts_DEGs* - **Type of table operation**: *Perform a full table operation* - **Operation**: *Custom* - **Custom expression on ‘table’, along ‘axis’ (0 or 1)**: *table.sub(table.mean(1), 0)* - Çalıştırılır. :::  Çıktı dosyasından **Table Compute** tool’u ile yeniden hesaplama yapılır. :::success - **Input Single or Multiple Tables**, *Multiple Table* - 1: Tables: **Table**: *Normalized_counts_DEGs* - 2:Tables: **Table**: *ilk Table Compute operasyonunun çıktısı* - **Custom expression on ‘tableN’**: *table2.div(table1.std(1),0)* - Çalıştırılır ve çıktı dosyası *Z_score_table* olarak isimlendirilir. :::  Elde edilen Z-score tablosundan **heatmap2** tool'u ile heatmap oluşturulabilir. :::success - **heatmap2** tool'unda; - **Girdi dosyası**: *Z_score_table* - İstenilen bir başlık belirlenir (örneğin, *Z-scores of DEGs*). - **Data transformation**: *Plot the data as it is* - **Enable data clustering**: *Yes* - **Labeling columns and rows**: *Label columns and not rows* - **Coloring groups**: *Blue to white to red* - Çalıştırılır. :::  Çıktı Grafiği:  ---