# Sequencing universe 定序的世界

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## 基因定序的發展流變
自2003 [Human Genome Project](https://en.wikipedia.org/wiki/Human_Genome_Project) 完成首個人類全基因體定序後，便打開了基因體學及定序研究的大門，而其中一門重要學問，便是定序技術的研發；前面所提到的第一組全基因體定序，是由多個實驗室共同參與、花費近13年完成，但現在只需單一實驗室進行樣本前處理、利用一台定序儀器，花費不到一天就可完成；不僅是定序效率的精進，就連定序價格也以違反摩爾定律的速度逐年降價，不僅讓定序變得更平易近人（相較於2003年），更使基因體資訊成為熱門的研究材料。
上圖為基因定序價格隨時間的改變，可發現在2008年左右定序價格驟降，其中一個原因是第二代定序儀器的上市與應用，目前（2021年）做一次全基因體定序的價格約為1,000美金，未來仍有持續降價的可能。
圖片來源：https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Sequencing-Costs-Data

本篇文章將介紹定序的發展，包含定序原理、（過去及現在）代表公司，讓大家鑑往知來，並持續投入定序的世界。
## 四大定序原理
定序究竟怎麼做？需要的材料是什麼？可分成四大原理
* chemical degradation
* sequencing by synthesis
* 利用template, primer, DNA polymerse 及鹼基等基本材料，在鹼基與目標序列互補後生成另一股的同時、一邊收集鹼基結合所釋放的訊號來完成定序。
* 例子：Sanger sequencing, Illumina, Ion Proton, PacBio
* sequencing by ligation
* 利用帶有訊號的probe與目標序列進行互補結合，一次定序大於一個以上的序列位置。
* nanopore
* 利用特殊的孔洞設計，在序列通過孔洞的時，透過鹼基所帶有的特殊訊號（如電流等）來完成定序。
* 例子：Illumina, Oxford Nanopore, Roche
## 第一代定序: Sanger sequencing
Sanger 最精巧的設計便是使用兩種不同的鹼基：dNTP以及ddNTP來進行定序，下圖是兩者的差異，可發現ddNTP因為3號碳缺少-OH，在其5號碳與上個鹼基結合後，無法再接上下一個鹼基，並終止整條序列的合成。

圖片來源：https://geneticeducation.co.in/what-is-the-role-of-ddntps/

因此他設計了4個定序槽，每個槽分別加入一種ddNTP配上其他三種鹼基的dNTP，如ddATP+dCTP+dGTP+dTTP，當目標序列投入此定序槽後，若序列是T則ddATP會和其互補，並生成大小不一的定序片段，最後將這四個定序槽收集到的序列拿去跑毛細管電泳，可以依照不同序列大小進行排序，拼湊出每個位置的互補鹼基。
圖片來源：https://www.sigmaaldrich.com/TW/en/technical-documents/protocol/genomics/sequencing/sanger-sequencing

Sanger 面臨的問題之一為相當耗時，因此目前會將螢光標記在鹼基上面，透過激發螢光的方式，加快定序效率；另外則是讀長問題，目前Sanger主要的應用是幫助驗證第二代定序的結果，如想確認某變異是否真實存在，可透過Sanger sequencing抓取特定片段的資訊來驗證。

## 第二代定序: Next generation sequencing(NGS)
因為全基因體的長度約有3100Mb，若使用Sanger sequencing將會定序到天荒地老；第二代定序的最大特色，便是將序列打成片段（genomic shotgun/fragmentation）、將序列PCR放大後同時定序多個小片段，最後再拼湊回整條序列，主要流程如下圖所示：
圖片來源：Loman et al, *Nat Rev Microbiol* (2012) 10:59
* fragmentation:利用不同物理方法打成片段
* tagging:利用一組barecode標記不同來源的序列，可以應用於一次定很多sample的時候
* amplification:PCR放大是二代定序最重要的夥伴，有了PCR放大，每個片段可加深定序次數，並有助於修正定序錯誤（訊號較強）其放大方法又可分成以下幾種：


圖片來源：Goodwin, S., et al, *Nat Rev Genet* 17, 333–351 (2016)
* sequencing: 不同公司所使用的定序技術不大相同，以下介紹幾家著名的定序公司。

### Illumina
次世代定序的霸主，為目前的主流定序方法，目前市佔率 >80%，應用範圍相當廣泛，舉凡臨床基因體定序、族群基因體定序都可使用。定序過程的特點包含：
* bridge amplification
* 具有不同讀長的定序機型可選擇，如Hiseq, Novaseq等
* 準確率 >99%

### Ion Torrent/Proton
特點為利用鹼基互補結合時，所釋放出的氫離子會改變PH值來定序。

## 第三代定序: long read sequencing
第二代定序雖是目前主流，但仍有無法達成的極限，如受讀限制而無法定序出高度重複的區域，或是處理大片段結構變異的表現不如預期等；第三代定序的其中一個特色，便是增加序列讀長，保留更完整的序列資訊，另外一點便是不用PCR放大，減少樣本前處理，目前以PacBio及Oxford Nanopore兩公司為三代定序開發的大宗。

### Pacific Bioscience (PacBio)
PacBio 定序方式又稱作single-molecule real-time (SMRT)，其特點主要分成兩部分：
* primer design:為了克服不經PCR放大及定序長片段的目標，PacBio在primer設計下了功夫，分別為circular consesus sequence (CCS) 以及continuous long read (CLR)，如下圖所示，CCS所使用的primer可以將序列環化，而CLR則將primer皆在兩股read前後，形成一啞鈴型結構；環化的優點包含可以一次抓住整段序列，使polymerase binding後，不停的在read上進行定序，並多次定序同個片段，以降低定序錯誤率。

圖片來源：https://www.ndsu.edu/pubweb/~mcclean/plsc411/Pacific%20Biosciencs%20CCS%20vs%20CLR%20modes.pdf
* Zero Mode Waveguide(ZMW): 晶片上特殊的孔洞設計，使每個孔洞中街具有一個polymerase，當序列進入孔洞，將會通過polymerase不停合成序列，並回報因互補接上的鹼基所帶有的螢光訊號，具有real time sequencing的能力。

PacBio在長序列的場合獲得好評，但仍無法達到如Illumina的定序準確度，未來將以降低定序錯誤率為主要目標。
### Oxford Nanopore Technology(ONT)
Nanopore指的是一個類似生物魔上的穿膜蛋白，當序列通過時，將會辨識不同鹼基所產生的微量電流訊號，來完成不用精PCR放大的即時定序。
如同三代定序的缺點，準確度仍然是一大門檻，且孔洞對於序列中有多個重複鹼基(homo-polymer)的辨識有待加強（好像二代定序也常出錯）。

## 相關文獻

> Goodwin, S., McPherson, J. & McCombie, W. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet 17, 333–351 (2016). https://doi.org/10.1038/nrg.2016.49
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