# NGS data analysis & file format 定序資料分析與檔案類型(2)

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## Variant Calling and VCF format
變異偵測(variant calling)不僅是做定序分析的重要目的之一，也是影響臨床決策如：偵測致病位點、精準畫醫療的分析方法，依據變異種類、定序資料類型以及，來選擇適合的變異偵測工具，如最常使用的GATK best practice就是用來偵測DNA-sequence中SNV/INDEL的方法，另外像長片段的結構性變異，可以使用如manta, lumpy等工具，在癌症變異偵測上，可使用GATK開發的Mutect2，利用正常組織樣本及腫瘤樣本，來找出體細胞的變異；由於工具選擇豐富，不少review paper以協助整理個工具特性，評估要點包含：
> Zhao, S., Agafonov, O., Azab, A. et al. Accuracy and efficiency of germline variant calling pipelines for human genome data. Sci Rep 10, 20222 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-77218-4
>
> Mahmoud, M., Gobet, N., Cruz-Dávalos, D.I. et al. Structural variant calling: the long and the short of it. Genome Biol 20, 246 (2019). https://doi.org/10.1186/s13059-019-1828-7
* 執行時間(run time)、硬體性質(CPU, RAM)、環境要求(docker, terminal)
* 偵測變異種類(SNV/INDEL, SV, CNV)
* 樣本類型(germline or somatic)(DNA, RNA or cDNA)
* 偵測準確率(accuracy): 透過[GIAB](https://www.nist.gov/programs-projects/genome-bottle)釋出的truth set來做benchmark & validation

紀錄變異位置及內容的檔案為variant calling format (VCF)，他的格式固定，包含：
* information description(contain ##)
* CHROM / POS
* REF/ALT
* QUALITY / FILTER
* INFO
* FORMAT / genotype

若想針對VCF進行變異篩選，可透過以下幾種工具：[bcftools](https://samtools.github.io/bcftools/bcftools.html)或[vcftools](http://vcftools.sourceforge.net)來進行；若想根據位置名單篩選，也可使用[bedtools](https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/)來分析

## Quality Control for VCF:
* Variant Quality Score Recalibration (VQSR)
不僅定序深度品質可以校正，變異的品質也可以根據常見的變異進行校正和篩選，這個步驟稱為VQSR，同樣以機器學習的方法，拿具有公信力的變異記載資料庫如：Hapmap、1000 Genome Project、HapMap或dbSNP等當作標準
> 挑出和已知的變異集合Overlap的位點（通常是HapMap資料集）——並分配相應的可信度權重來進行訓練，來區分變異的好壞

* sample quality control
偵測變異的存在不僅受到深度影響，在一群cohort sample中變異出現的頻率也相當重要，甚至影響資料解讀，因此針對樣本的差異性，也有品質校正的方法：性別是否平均、樣本是否具有親緣關係、或是樣本族群來源等，族群一般可透過PCA進行降維分群。

## Annotation
找到變異後，該如何衡量變異對下游及生理表現的影響？或是針對某種遺傳疾病，挑選出符合模式假設的變異呢？以上的操作都屬於annotation（註解）的範疇，可以分成兩類：
* genotype annotation：主要利用vcf檔記載的資訊進行變異篩選與註解，像是針對變異genotype的**FORMAT annotation**和變異深度、頻率、正負股來源的**INFO annotation**

* variant annotation：主要是資料庫對照，將過去針對同變異位點做過的研究結果，整合進vcf當中，以成為我們篩選的標準。舉例來說：在臨床上找尋致病位點時，常會將病人樣本找到的變異做annotation，並利用ACMG class或Varsome等評分，當作變異是否為治病位點的依據；一般位點篩選還會搭配深度、資料庫記錄的 population allele frequency(若要找罕病位點、卻發現變異在population freq很高就有矛盾)等層層條件，來過濾並縮小目標範圍；目前兩大annotation工具包含：
* Annovar
* AnnotSV

基本上NGS分析做到annotation就完成了，若有找到感興趣的變異位點，會透過dry lab等分子實驗進行驗證，或是利用其他軟體模擬、預測變異的影響，最後補充幾個annotation可以參照的資料庫。
* Genome inforamtion (refGene/knownGene/ensGene)
* Minor allele frequency (ExAC/gnomad/TWB/others)
* Functional annotation (ClinVar/OMIM/others)
* Variant effect prediction (SpliceAI/PrimateAI/others)

## Other data format

### BED format
紀錄**位置資訊**的檔案類型，一般會有三行：chromosome/start position/end position，BED format可作為篩選VCF的條件，像是confident region的過濾等。而利用變異位置作為篩選資訊的工具為bedtools，可針對不同樣本在同一區域下的變異交集、聯集或是出現次數進行統計。

### PED format
在cohort study或是pedigree分析時常用到的檔案類型，PED主要記載的是樣本的家庭資訊，包含family ID / individual ID / paternal ID / maternal ID / sex / phenotype / genotype 幾種資訊


## Reference
> vcf format
> https://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.2.pdf
>
> VQSR
> https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035531612-Variant-Quality-Score-Recalibration-VQSR-
>
> PED format
> https://www.researchgate.net/figure/Overview-of-various-commonly-used-PLINK-files-SNP-single-nucleotide-polymorphism_fig3_323424714