# Tutorial para IV Curso de Bioinformática da FCAV/Unesp

###### tags: `Curso de Bioinformática` `Filogenômica` `Aula prática` `Unesp`
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# Link para o tutorial:
# http://bit.ly/cvbioinfophylo

<iframe src="//www.slideshare.net/slideshow/embed_code/key/xDzSgS5fJnslrh" width="595" height="485" frameborder="0" marginwidth="0" marginheight="0" scrolling="no" style="border:1px solid #CCC; border-width:1px; margin-bottom:5px; max-width: 100%;" allowfullscreen> </iframe> <div style="margin-bottom:5px"> <strong> <a href="//www.slideshare.net/saurasilva/filo-4-cursobioinfo" title="Filo 4 curso_bioinfo" target="_blank">Filo 4 curso_bioinfo</a> </strong> from <strong><a href="https://www.slideshare.net/saurasilva" target="_blank">saurasilva</a></strong> </div>

:::warning
### Antes de olhar este manual prático

* Antes de começar a usar este tutorial é fundamental que você tenha conhecimentos básicos sobre o sistema **UNIX**, para adquirir este conhecimento, você pode começar a treinar pelo tutorial de comandos básicos para usar nos sistemas **UNIX**, que pode ser encontrado neste link: ....

* Contudo, para os usuário que já estão familiarizados com o sistema **UNIX**, basta fazer o **download** dos programas assinalados na seção do tutorial [Programas que serão usados na atividade prática](https://hackmd.io/6ikGY4F2QaG6H05Ao39kzA?both#Programas-que-ser%C3%A3o-usados-na-atividade-pr%C3%A1tica) e de preferência colocar todos os programas na variável _$PATH_, exceto o programa _get_homologues_.

* Tenha sempre em mente que o que será abordado aqui será o *café com leite*, ou seja, será só o básico direcionado para a aula que vocês tiveram durante o curso. Todos os programas usados possuem uma gama incrível de ferramentas e opções que devem ser customizadas de acordo com os seus dados, - além de estar em constante atualização - portanto pesquise sobre os programas, **LEIA O MANUAL DE CADA FERRAMENTA** para sempre usá-las de maneira adequada.

* Os textos em caixas escritos na cor “verde” denotam comentários sobre os parâmetros usados no exemplo do tutorial.

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# Índice

* [1) Preparação do ambiente para fazer as análises](https://hackmd.io/GTluEod2SfCF5BJ1sHZeMg#1-Prepara%C3%A7%C3%A3o-do-ambiente-para-fazer-as-an%C3%A1lises)
* [2) Input - obtenção dos genomas](https://hackmd.io/GTluEod2SfCF5BJ1sHZeMg#2-Input---Obten%C3%A7%C3%A3o-dos-genomas)
* [3) Obtenção de sequências homólogas dos genomas](https://hackmd.io/GTluEod2SfCF5BJ1sHZeMg#3-Obten%C3%A7%C3%A3o-de-sequ%C3%AAncias-hom%C3%B3logas-dos-genomas)
* [4) Alinhamento das sequências](https://hackmd.io/GTluEod2SfCF5BJ1sHZeMg#4-Alinhamento-das-sequ%C3%AAncias)
* [5) Concatenar genes para uma supermatriz](https://hackmd.io/GTluEod2SfCF5BJ1sHZeMg#5-Concatenar-genes-para-uma-supermatriz)
* [6) Inferindo a filogenia por Máxima Verossimilhança (IQ-Tree)](https://hackmd.io/GTluEod2SfCF5BJ1sHZeMg#6-Inferindo-a-filogenia-por-M%C3%A1xima-Verossimilhan%C3%A7a-IQ-Tree)
* [7) Visualização da árvore](https://hackmd.io/GTluEod2SfCF5BJ1sHZeMg#7-Visualiza%C3%A7%C3%A3o-da-%C3%A1rvore)

## 1) Preparação do ambiente para fazer as análises

### Sistema operacional necessário para realizar a prática:

O sistema operacional que será usado na aula será o **Linux**. Há inúmeras vantagens em usar o Linux, entre elas a liberdade de criar _scripts_ na linguagem _shell_ para realizar tarefas simples para um grande número de dados e o fato de que a grande maioria dos programas em bioinformática foram escritos para sistemas **UNIX** como Linux e MACOS.

#### Criar hierarquia de arquivos:

Para isso devemos entrar no servidor:


E dentro na sua pasta (~):

cd ~/

vamos criar os arquivos:

mkdir -p Phylogenomics/
mkdir -p Phylogenomics/Alignment/
mkdir -p Phylogenomics/Seqs_Renamed/
mkdir -p Phylogenomics/Concat_300/
mkdir -p Phylogenomics/IQ-Tree/

cd Phylogenomics/

E copiar os arquivos da pasta _/data/cvbioinfo/phylo/_:

cp -r /data/cvbioinfo/phylo/ .

ls

:::success
> [name=Nota sobre comandos]
> **Comandos shell**
> mkdir -> criar pastas (_make directory_)
> mkdir -p -> criar pastas dentro de pastas caso não existirem
> cd -> mudar de diretório (_change directory_)
> ls -> Listar diretórios de uma pasta (_list)
> cp -> copiar arquivos a partir de uma origem [/data/cvbioinfo/phylo] para um destino [.] - o "." denota a pasta que você esta atualmente, ou seja, a pasta _Phylogenomics_
> cp -r -> copiar todos os arquivos e pastas (_recursivamente_)

:::

# 2) Input - Obtenção dos genomas

## Sequências que serão usadas na prática:

Para realizar esta prática, escolhemos usar 10 genomas de bactérias, sendo 9 do gênero _Xanthomonas_ e 1 do gênero _Xylella_ que será usado como grupo externo:

:::warning

| N. Acesso | Nome da espécie |
| -------- | -------- |
| NC_007086.1 | _Xanthomonas campestris_ pv. _campestres_|
| NZ_CP009037.1 | _X. citri_ subsp. _citri_ |
| NC_016010.1 | _X. axonopodis_ pv. _citrumelo_ |
| NC_007508.1 | _X. campestris_ pv. _euvesicatorica_ |
| NC_022541.1 | _X. funscans_ subsp. _fuscans_ |
| NZ_CM002264.1 | _X. axonopodis_ pv. _glycines_ |
| NZ_CP012947.1 | _X. oryzae_ pv. _oryzae_ |
| CP002789 | _X. campestris_ pv. _raphani_ |
| NC_013722.1 | _X. albilineans_ |
| NC_004556.1 | Grupo externo: _Xylella fastidiosa_ |
:::

### Obtenção dos genomas a partir do GenBank

Para este tutorial iremos decompactar o arquivo compactado _input_ dentro da pasta que copiamos _phylo/_ e

cd phylo

Para descompactar o arquivo input, para isso, devemos digitar o comando:

unzip input.zip

Dentro dos arquivos GB podemos observar arquivos genbank **.gb** das várias espécies de _Xanthomonas_.
Para verificar o conteúdo dos arquivos podemos usar o comando _less_ ou _more_.

less GB/CP002789.gb

mover a pasta **GB** para a pasta **Phylogenomics**

mv GB/ ../

:::success
> [name=Nota sobre comandos]
> **Comandos shell**
> > cd -> mudar de diretório (_change directory_)
> unzip - programa para descompactar arquivos
> mv - comando para mover pastas/arquivos [GB/] para um destino [../] - o "../" denota destino para a pasta anterior a que está no momento.
>

:::
# 3) Obtenção de sequências homólogas dos genomas

### Usar Get_homologues para extrair regiões "homólogas" por meio de clusterização (agrupamento) de regiões do DNA dos genomas:


:::success
Para mais informações, ver publicação em: [GET_HOMOLOGUES, a versatile software package for scalable and robust microbial pangenome analysis.](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24096415)
:::

A partir da pasta _phylo/_, temos que entrar na pasta no programa get_homologues/ para executar o programa.

Para isso vamos usar o comando:

cd get_homologues/

Para usar obter os clusteres de sequências, vamos usar o programa _Get_homologues_. Para usá-lo neste exemplo, basta digitar o seguinte comando:

./get_homologues.pl -d ../../GB/ -M -X

Isto pode **demorar**... Se **demorar**, vamos copiar o arquivo _GB_homologues_ dentro da pasta _ana_maria_braga_ para a pasta _get_homologues_.

Para isso vamos primeiro cancelar o processo pressionando as teclas no teclado **Ctrl+C**

deletar o arquivo que foi criado pelo programa:

rm -rf GB_homologues

E copiar o arquivo _GB_homologues_ que está dentro da pasta _ana_maria_braga_ para a pasta _get_homologues_ da seguinte maneira:

cp -r ana_maria_braga/GB_homologues/ .

:::success
>[name=Nota sobre comandos]
>**Comandos do get_homoleogues.pl**:
>
>-d -> informar a pasta em que os arquivos genbank estão.
>-M -> usar o OrthoML para clusterizar sequências.
>-X -> usar o programa Diamond para fazer o BlastP dos genomas.
>
>
>
>**Comandos do Shell:**
>rm -> remover arquivos
>rm -rf -> remover arquivos e diretórios dentro de diretórios
>cp -> copiar arquivos
>cp -r -> copiar arquivos e pastas (recursivamente)
:::

### Comparar Clusteres de sequências:

Este comando irá gerar uma cópia de sequência ortóloga por família gênica.
Ademais, com o programa get_homologues podem usar mais de um algoritmo de busca por clusteres além do OrthoMCL, como o COG triangles e o BHBD, portanto o compare_clusters tem como objetivo fazer o **consenso dos clusteres**.

./compare_clusters.pl -d GB_homologues/NC004556Out_dmd_f0_alltaxa_algOMCL_e0_/ -o ../../Xan_compareclust

Vamos entrar na pasta Xan_compareclust/

cd ../../Xan_compareclust

E observar os arquivos das sequências clusterizadas:

less 4521_chromosomal_replicat...faa 

Contudo, antes de continuarmos os próximos passos, iremos renomear os arquivos para que sejam interpretáveis para os próximos programa, haja vista que o arquivo de saída gera um arquivo com nome de sequência grande e cheio de caracteres que os próximos programas que iremos usar podem não reconhecer.

:::success

>[name=Nota sobre comandos]
>**Comandos do Compare_Clusters**
> -d -> diretório com os clusteres criados a partir do get_homologues
> -o -> diretório que será criado para abrigar arquivos que serão gerados
>
>**Comandos do Shell**
>less -> visualizar conteúdo do arquivo; para sair da visualização, pressione _"q"_ no teclado.
:::

### Renomear as sequências

Copiar o script _rename_seqs.sh_ da para scripts para a pasta **Xan_compareclust/**.

Usar o Terminal com o comando:

cp ../../../../phylo/scripts/rename_seqs.sh .

executar o script **rename_seqs.sh** dentro da pasta **Xan_compareclust/**

./rename_seqs.sh

:::success

>[name=Nota sobre comandos]
>
>**Comandos do Shell**
>cp -> copiar um arquivo de uma origem [../../../../phylo/scripts/rename_seqs.sh] para um destino [.] - os "../" denotam mudar para a pasta anterior, já o "." denota a pasta local.
>./ -> executar o programa na pasta local

:::danger
:exclamation:O **Script** não funcionará se não estiver na mesma pasta dos arquivos a serem renomeados
:::

### Mover arquivos renomeados

Para melhor organização do trabalho, vamos mover as sequências que estão renomeadas para outra pasta que já havíamos criado no começo chamada de **Seqs_Renamed**.
Para fazermos isso, podemos usar o comando shell:

mv *.ren.fas ../Seqs_Renamed/

E vamos verificar se os arquivos estão na pasta mudando para o diretório _Seqs_Renamed_

cd ../Seqs_Renamed

ls

:::success

>[name=Nota sobre comandos]
>
>**Comandos do Shell**
>mv -> move um arquivo de uma origem [*.ren.fas] para um destino [../Seqs_Renamed] - o *.ren.fas denota que deverá mover todos "*" os arquivos com extensão ".ren.fas", já os "../" denotam mover para a pasta Seqs_Renamed que se encontra na pasta anterior "../".
>cd -> mudar de diretório (_Change Directory_)
>ls -> listas arquivos do diretório (_List_)

:::

# 4) Alinhamento das sequências

O tutorial serve como exemplo para efetuar as suas análises portanto vamos selecionar um conjunto de sequenciar, como por exemplo todas as sequências que começam com 5.
Para copiar todas as sequências de uma vez, podemos usar o comando:

cp 5* ../Alignment/

Ao fazer isso, estamos copiando **387** genes para fazer nossa filogenômica.

### Alinhar as sequências usando o programa MAFFT

Entrar na pasta em que serão executados os alinhamentos:

cd ../Alignment/

Copiar o script _align_seqs_mafft.sh_ da pasta scripts para a pasta **Alignment/**

cp ../phylo/scripts/align_seqs_mafft.sh .

executar o script **align_seqs.sh**

./align_seqs_mafft.sh

### Verificar o alinhamento das sequências:

Mesmo em Filogenômica devemos verificar **TODOS** os alinhamentos com programas de visualização de alinhamentos para garantir que todos os arquivos foram alinhados de maneira correta.

Para fazer isso, podemos usar o programa **Bioedit**, **Geneious**, ou o **Seaview** (etc.)

Links para Download estão disponíveis na seção [Inspeção visual dos alinhamentos](https://hackmd.io/6ikGY4F2QaG6H05Ao39kzA?both#Inspe%C3%A7%C3%A3o-visual-dos-alinhamentos)

Após inspeção visual, observamos que três arquivos possuem sequências duplicadas, provavelmente por parâmetros a serem ajustados na clusterização, portanto vamos retirar estas três sequências:

 rm 5594_trans-2-enoyl-CoA_re.align_mafft.fas
 rm 5708_beta-ketoacyl--acyl-.align_mafft.fas
 rm 5855_TonB-dependent_recep.align_mafft.fas

:::success

>[name=Nota sobre comandos]
>
>**Comandos do Shell**
>chmod a+x -> mudar o tipo de arquivo e tornar o arquivo executável (como se fosse o .exe do windows)
>./ -> executar o programa na pasta local
>rm - remover arquivos
:::danger
:exclamation:O **Script** não funcionará se não estiver na mesma pasta dos arquivos a serem alinhados
:::

# 5) Concatenar genes para uma supermatriz

### Concatenar alinhamentos usando o programa FASconCAT:

Para concatenar os arquivos, todas as sequências de cada táxons devem estar com o mesmo nome ou o programa não funcionará de maneira correta:

:::info
Por isso que usamos o script **./rename_seqs.sh**
:::

Arquivos devem estar na mesma pasta do programa.
Portanto vamos mover todos os arquivos alinhados para a pasta _Concat_300_ e entrar na pasta para executar o programa que irá concatenar os alinhamentos

 mv *.align_mafft.fas ../Concat_300/

 cd ../Concat_300/

E executar o programa que concatena todos os alinhamentos em uma supermatriz:

FASconCAT_v1.11.pl -i -s

Se o processo for bem sucedido, aparecerá o seguinte resultado:


Portanto o arquivo a ser usado na análise filogenética é o alinhamento que esta dentro do arquivo **FcC_smatrix.fas**.

:::success

>[name=Nota sobre comandos]
>**Comandos do FASconCAT**
>
>-i -> tabela com informações sobre os alinhamentos incluídos na análise (arquivo FcC_info.xls)
>-s -> executar programa

>:exclamation: No exemplo, o programa já está na variável $PATH.

:::danger
O **Script** não funcionará se não estiver na mesma pasta do que os arquivos a serem renomeados
:::

# 6) Inferindo a filogenia por Máxima Verossimilhança (IQ-Tree)

### Análise filogenômica com o método de Máxima Verossimilhança com o programa IQ-Tree

Para construirmos árvores de máxima verossimilhança (_maximum likelihood_) podemos usar vários programas. Inclusive os mesmos que empregamos para poucas sequências. Contudo, há alguns algortimos que são mais otimizados que outros e o programa IQ-Tree tem algoritmo que faz análises rápidas para um conjunto grande de dados (como os dados de filogenômicas), contudo o programa usa alguns "Atalhos" para obter estas árvores mais rapidamente, como por exemplo o algortimo de branch-swapping NNI e bootstrap especial chamado Ultrabooststrap. Todos estes "Atalhos" podem influenciar ou não os resultados da análise. Portanto, caso usar este programa e seu resultado não for satisfatório, recomendamos usar outros programas de filogenia, portanto, não deixe para fazer as suas análises quando estiver perto do prazo de entrega dos seus resultados.

Para este tutorial, vamos aprender duas maneiras de usar o IQ-TREE, via [web-server da ferramenta](https://hackmd.io/6ikGY4F2QaG6H05Ao39kzA?both#Usando-o-web-server) ou via o [seu servidor](https://hackmd.io/6ikGY4F2QaG6H05Ao39kzA?both#Usando-o-seu-servidor).

### Usando o Web-Server:

Para usar o servidor online do IQ-tree, deverá entrar no link:
http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/


Após entrar no link, carregar a matriz concatenada que foi gerada a partir do programa FASconCAT clicando no botão **Browser...**



Selecione o arquivo, e escreva seu endereço de email para que o servidor mande um email quando a análise acabar:



Submetido, a janela aparecera com os seus processos:


E enquanto estiver indicado como **Running**, significa que o processo ainda nao terminou:


Ao término a análise no servidor online, obterá o seguinte resultado e deverá selecionar a análise que submetemos no ícone [X] na coluna à esquerda do navegador:



Após isso, você deverá fazer o Download dos resultados clicando no botâo **Download Selected Results** logo abaixo do processo da análise:



E descompactar os arquivos:
png)

Sua árvore de Máxima Verossimilhança está no arquivo **FcC_smatrix.fas.treefile**


Para visualizá-la deverá abrir este arquivo em algum programa de árvores, como na seção [Visualização de árvores usando o FigTree](https://hackmd.io/6ikGY4F2QaG6H05Ao39kzA?both#Visualiza%C3%A7%C3%A3o-da-%C3%A1rvore-usando-o-FigTree)

### Usando o seu servidor:

Entrar na pasta IQ-Tree/ e copiar a matriz concatenada para a pasta IQ-Tree com os comandos:

cd ../IQ-Tree/

cp ../Concat_300/FcC_smatrix.fas .

E executar a linha de comando para o IQ-Tree calcular a árvore:

iqtree -s FcC_smatrix.fas -m TEST -bb 1000 -nt AUTO

Com esta linha de comando, o programa IQ-Tree irá:

1. Fazer a seleção do Modelo (com o ModelFinder) para encontrar o Modelo _best-of-fit_
2. Construir a árvore de ML com o modelo selecionado pelo programa.
3. Avaliar valor de suporte por meio do Ultrafast bootstrap.

:::success

>[name=Nota sobre comandos]
>**Comandos do IQ-Tree**
>
>-m -> testar modelos evolutivos
>-s -> input de arquivo (no exemplo está em *.fasta)
>-bb -> realizar o ultrafastbootstrap com n pseudoréplicas
> -nt AUTO -> Selecionar automaticamente o número de processadores a serem usados

>:exclamation: No exemplo, o programa já está na variável $PATH.

:::danger
Se não estiver no $PATH, o programa não funcionará se não estiver na mesma pasta do que os arquivos
:::

Após o termino da análise, serão gerados os arquivos:


Os arquivos que devemos prestar mais atenção neste tutorial são:

**FcC_smatrix.iqtree**: Arquivo que são encontrados o relatório dos resultados do programa. É importante verificar este arquivo para saber se foram encontrados erros na sua análise. Também contém uma representação na forma de texto da árvore final.
**FcC_smatrix.treefile**: the ML tree in NEWICK format, which can be visualized in FigTree.
**FcC_smatrix.log**: log file of the entire run (also printed on the screen).

Para otimizar o tempo, faça o download do arquivo e abra no programa FigTree do seu computador.

Caso não tenha o programa, vá para a seção [Figtree download](https://hackmd.io/GTluEod2SfCF5BJ1sHZeMg?both#Visualizacao-das-arvores-FigTree) para instruções de instalação.

Leituras adicionais:

+ ModelFinder: [Kalyaanamoorthy et al. (2017)](https://www.nature.com/articles/nmeth.4285).
+ IQ-TREE search algorithm: [Nguyen et al. (2015)](https://doi.org/10.1093/molbev/msu300).
+ Ultrafast bootstrap: [Minh et al. (2013)](https://doi.org/10.1093/molbev/mst024).

# 7) Visualização da árvore

Existem diversos softwares para visualização de árvores:

Download de [IQ-tree de Xanthomonas](https://drive.google.com/file/d/1YMy-O7nJNT5kfAIfmb-m6cgSJGT216yK/view?usp=sharing)

**Softwares online:**

* [Phylo.IO](http://phylo.io/)
* [Tree of Life viewer (iTOL)](https://itol.embl.de/)
* [EvolView](https://www.evolgenius.info/evolview/#mytrees/EXAMPLES/Sample%20tree%201(Simple%20tree%20example))

**Para Download:**

* [FigTree](http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)
* [DensiTree](https://www.cs.auckland.ac.nz/~remco/DensiTree/)
* [TreeGraph](http://treegraph.bioinfweb.info/)

### Visualização da árvore usando o FigTree

Abra o programa Figtree:


e abrir o árquivo **FcC_smatrix.fas.treefile**


Editar a árvore - valores de bootstrap estão dentro de "label".

## Programas que serão usados na atividade prática:

:::info
As instruções dadas no tutorial são para sistemas **UNIX** (foram testados no Ubuntu e Lubuntu), para sistema do Windows, por favor seguir as instruções nos manuais dos programas
:::

### Obter sequências homólogas

+ [Get_Homologues](https://github.com/eead-csic-compbio/get_homologues/releases/tag/v3.2.2)
+ Para mais informações, ver publicação em: [GET_HOMOLOGUES, a versatile software package for scalable and robust microbial pangenome analysis.](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24096415)

* Para efetuar a instalação:

Descompactar os arquivos

tar -xzvf [nome_do_programa]

Entrar na pasta que o programa foi instalado:

cd [nome_do_programa]

Instalar programa (Instalar as dependências):

perl ./install.pl

### Alinhamento de sequências

+ [MAFFT - versão para SO](https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/linux.html)

+ [MAFFT - versão online](https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)

Para instalar o MAFFT no linux:

wget https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/mafft_7.427-1_amd64.deb


sudo dpkg -i mafft_7.427-1_amd64.deb

### Inspeção visual dos alinhamentos

+ **Seaview**

http://pbil.univ-lyon1.fr/software/seaview3

+ **Bioedit**

http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html

### FASconCAT

+ **Download:**

[Download ](https://github.com/PatrickKueck/FASconCAT) do script para concatenar baseado na liguagem Perl. Para este programa funcionar você deve ter o interpretador de programas Perl instalado. Funciona em todos os sistemas operacionais.


Descompactar os arquivos

tar -xzvf [nome_do_programa]

Entrar na pasta que o programa foi instalado:

cd [nome_do_programa]

Para verificar se está funcionando, basta inserir o comando no Terminal:

perl ./FASconCAT_v1.11.pl

### IQ-Tree

+ **Download:**

[Download ](http://www.iqtree.org/#download)de versões do IQ-Tree para Macintosh, Windows ou Linux.

Descompactar os arquivos

tar -xzvf [nome_do_programa]

Entrar na pasta que o programa foi instalado:

cd [nome_do_programa]/bin/

Para verificar se está funcionando, basta inserir o comando no Terminal:

./iqtree

+ **Input Format:**

Os alinhamentos devem estar nos formatos Fasta, Phylip ou NEXUS.

### Visualizacao das arvores: FigTree

+ **Download:**

[Download ](http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)de versões do FigTree para Macintosh, Windows, ou como um Java executável.

+ **Input Format:**

As árvores estar nos formatos Newick ou NEXUS.

###### Observação