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# Extração de DNA genómico de bacterias G+ e G- usando Wizard® Genomic DNA Purification Kit*
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*Esse protocolo consiste em adaptações do protocolo original do kit, feitas pelo grupo de Prof. Jesus Ferro para extração de DNA bacteriano de *Xanthomonas spp.*

Documento Preparado por: Luis Teheran
Jul 2020

#### Protocolos
[Protocolo Resumido (Quick Protocol PDF)](https://www.promega.com.br/-/media/files/resources/protcards/wizard-genomic-dna-purification-kit-quick-protocol.pdf?la=pt-br)
[Protocolo Completo (Complete Protocol PDF)](https://www.promega.com.br/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/0/wizard-genomic-dna-purification-kit-protocol.pdf?la=en)

#### Referencia
[Comparison of six commercial kits to extract bacterial chromosome and plasmid DNA for MiSeq sequencing](https://www.nature.com/articles/srep28063.pdf)

## Procedimiento

##### 1. Cultura:
Crescer as bacterias em medio de cultura e volume adecuado até atingir uma D.O. de 1,0 ou até o final da fase logarítimica. Para bacterias de crescimento rápido (*E. coli*) a cultura overnight ou de 14 horas é suficiente. Segundo o Kit, 1 ml da cultura pode ser suficiente para começar a extração.
É possível usar inóculos congelados e preservados em glicerol, sempre que tenham a quantidade adecuada de células, pois disso dependerá o rendimento da extração. É recomedavel retirar o glicerol e restos de meios de cultura/tampão fazendo pelo menos duas lavagens com solução estéril de NaCl 0,85% e peletanod as células centrifugando a 12.000 g / 2 min. e descartar o sobrenadante. Usar tubo eppendorf de 1, 5 mL.
##### 2. Preparo de células
Resuspender as células em 480 sol. de EDTA 50mM.
##### 3. Lisozima
* Adicionar 120 uL de lisozima (15 mg/ml).
Lembrar de preparar lisozima com água milli-q estéril, aliquotar e congelar. Agúns protocolos recomendan usar a enzima e descartar o sobrante, não congelar novamente.
##### 4. Digestão
Colocar os tubos em banho seco a 37°C por 30 minutos.
##### 5. Centrifugação
* Centrifugar por 2 min, 15.000 g, temperatura ambiente (centrifigua lab proteómica).
* Descartar o sobrenadante.
##### 6. Nuclei lysis
* Add 600 μL de Nuclei Lysis Solution (kit) pipetando suavemente para resuspender o pellet e mistruar bem.
* Colocar em baho seco a 80°C por 5 minutos.
##### 7. RNAse
* Add 3 μL de RNAse (Kit) a cada tubo e incubar a 37°C por 60 minutos em banho seco.
* Deixar resfriar os tubos temp. ambiente por 5 min. antes do seguinte paso.
##### 8. Protein Precipitation
* Add 200 μL de Protein Precipitation Solution (kit). Vortex x 20 segundos.
* Seguidamente colocar em cooler resfriado a -10°C por 5 minutos.
* Finalmente centrifugar a 15.000 g x 10 minutos.
##### 9. Precipitação
* Transferir o sobrenadante com cuidado para um tubo novo contendo 600 μL de isopropanol a temp. ambiente, fechar e inverir o tubo varias veces até aparecer fios brancos de DNA precipitado (isso vai depender da concentração total do DNA).
* Centrifugar a 15.000 g por 3 minutos e descartar o sobrenadante.
* Add 600 μL de etanol 70% recém preparado, misturar suavemente por inversão do tubo.
* Aspirar o etanol com a pipeta sim tocar o pellet, descartar o etanol.
##### 10. Secagem
* Deixar secar os tubos com a tampa aberta dentro do fluxo por 10 a 15 minutos sem deixar secar completamente o pellet.
##### 11. Reidratação do DNA
* Resuspender em 100 μL de agua ultrapura ou tampão, o kit recomenda resuspender usando a Rehydration Solution por 1 hora a 65°C ou overnight a 4°C.
##### 12. Quantificação
* Quantificar o DNA em nanodrop ou Qubit dsDNA HS Assay kit.

## Resumo Gráfico

###### Fim do documento