# QIIME2 - ITS (*Internal transcribed spacer*) 🍄
Neste tutorial 🗒 você vai aprender 🤓 a processar e analisar dados de sequenciamento *high throughput* do ITS (*Internal transcribed spacer*), utilizando um *pipeline open source* chamado 🔗[Qiime](https://qiime2.org/) *|chime|* (*Quantitative Insights Into Microbial Ecology*). Atualmente ele está na sua versão 2020.2, mas no nosso servidor temos instalada a última do ano passado (2019.10) ✅ que é mais estável.

## Colaboradores

* :female-scientist::female-technologist: MSc. Kelly J. Hidalgo Martinez
Microbióloga
Doutoranda em Genética e Biologia Molecular
Instituto de Biologia - UNICAMP
:iphone: Whastapp: [phone]
:mailbox_with_mail: Email: [e-mail]

* :male-scientist::male-technologist: Victor Borin Centurion
Biomédico
Doutorando em Genética e Biologia Molecular
Instituto de Biologia - UNICAMP
:iphone:Whastapp: [phone]
:mailbox_with_mail: Email: [e-mail]

* :male-scientist::male-technologist: Dr. Tiago Palladino Delforno
Biólogo
:mailbox_with_mail: Email: [e-mail]

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## Requisitos
**Importante**:exclamation:
Não comece este tutorial 🗒 se você ainda não leu e praticou com anteriores, listados aqui:
1. Não preparou seu 💻 para trabalhar no servidor? então vai em 🔗 [Preparativos para começar](https://) (Obrigatório)
2. Já tem uma ideia de que é a tela preta e como se navega nela? não? então vai em 🔗 [UNIX Shell - Linux](https://) (Obrigatório)
3. Você precisa conhecer o tipo de arquivos com os que vai trabalhar. Em 🔗 [Tipos de arquivos ](https://) encontra essa informação (Obrigatório).
4. Você precisa saber como activar e desactivar ambientes virtuais em Conda para o uso das ferramentas presentes no nosso servidor. Se ainda não passou por aí vai 🔗 [aqui](https://) (Obrigatório).
5. Este turorial 🗒 é uma continuação da parte II do tutorial 🗒 🔗[Control de qualidade e trimagem](https://). Então não dá para você começar aqui ⛔️. Além porque aí você vai aprender bem os parâmetros de qualidade neste tipo de dados. Vai lá primeiro então. Usando Qiime2 você consegue fazer o controle de qualidade também, mas sempre é bom conhecer diversos jeitos e ferramentas.
6. Para entender um pouco da estrutura do ITS e de barcoding 🔗[vai aqui](https://).

## Alguns tips interessantes antes de começar
Não esqueça de ter presentes estes tips 💁🏻‍♀️
* O tip mais importante é você ser sempre crítico 🤓 no que você está fazendo, **não** se trata de cópiar e colar comando 🙄, tente entender o que você está fazendo, que por trás de cada processo, o que está acontecendo 🤔. Este tutorial 🗒 é só um exemplo, mas tem muitos parâmetros para ser trocados segundo seus dados.
* Lembra da tecla [Tab] :keyboard: ? para autocompletar nomes de pastas 📁 e/ou arquivos e evitar erros de digitação.
* Com a seta para cima você pode voltar nos comandos que você já usou anteiormente.
* Lembre-se que a linha de comando é sensível a maiúsculas e minúsculas.
* Todo comando/programa tem um menu de ajuda **help**. `comando --help`
* Na linha de comando o simbolo `#`, significa que não vai ser executado, e é usado para deixar mensagens.
* Para descarregar 🔽 arquivos desde o servidor não esqueça de usar 🔗[Filezilla](https://)
**Recomendação** :exclamation: Não só se limite a cópiar e colar o comando 🙄, tente entender que está acontecendo e quais são as partes do comando 🤓.
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## Vamos lá! :beginner:

No tutorial 🗒 de **Control de qualidade e trimagem** você aprendeu como ver gráficamente a qualidade das *reads* e a filtrar aquelas com baixa qualidade, para levar as melhores para os análises *downstream*. Bem, agora vamos continuar trabalhando com essas sequências de boa qualidade e sem primers para avaliar a diversidade taxonômica das amostras exemplo.

### Pasta de trabalho

Lembre-se que a sua 📁 de trabalho é `/data/usuário/its_tutorial`

## Confira onde você está
pwd

Se não estiver em `/data/usuário/its_tutorial`, então use os comandos aprendidos para entrar na pasta. Precisa lembrar comandos? 🔗[Vai aqui!](https://)

### Ativar o qiime2 no conda
Se tiver dúvidas sobre como ativar ambientes no conda, 🔗[vai aqui](https://).

source /opt/Miniconda3/bin/activate qiime2-2019.10

## 4 Importar os arquivos `.fq` como *"artefato"* dentro do Qiime
Para importar os arquivos com as sequências já limpas e prontas para trabalhar dentro do Qiime2, é preciso criar um arquivo `.txt` onde vamos a colocar o nome das amostras, e os caminhos da 📁 onde estão os arquivos `.fq` forward e reverse. O arquivo vai ser chamado `ManifestFile.txt`.
Que é um artefato (`.qza`)? 🔗[Glosario qiime2](https://docs.qiime2.org/2020.2/glossary/). Por enquanto posso te adiantar que esse tipo de arquivo não pode ser "lido" por nenhum tipo de programa. Para conseguir visualizar o conteúdo destes arquivos é preciso transformar ele para um arquivo tipo *visualization* (`.qzv`).

# Abra o editor de texto nano 
nano ManifestFile.txt

Você pode copiar e colar o texto embaixo, mas leve em conta que, o arquivo `ManifestFile.txt` é um arquivo de texto separado por tabs, e só vai funcionar desse jeito, então verifique que ficou correto ✅.

## Colunas separadas por tab
sample-id	forward-absolute-filepath	reverse-absolute-filepath
amostra1	$PWD/03.CleanData/amostra1_r1_paired.fq.gz	$PWD/03.CleanData/amostra1_r2_paired.fq.gz
amostra2	$PWD/03.CleanData/amostra2_r1_paired.fq.gz	$PWD/03.CleanData/amostra2_r2_paired.fq.gz
amostra3	$PWD/03.CleanData/amostra3_r1_paired.fq.gz	$PWD/03.CleanData/amostra3_r2_paired.fq.gz
amostra4	$PWD/03.CleanData/amostra4_r1_paired.fq.gz	$PWD/03.CleanData/amostra4_r2_paired.fq.gz

Deve ficar assim:

## Para sair
Ctrl + x
## Para salvar
S
Enter

Antes de rodar o primeiro comando no qiime2, vamos aprender algumas generalidades sobre a estrutura dos comandos do qiime2.
1) Sempre começam com a palavra qiime
2) Enseguida se coloca a ferramenta a ser usada, p.e. tools, dada2, feature-classification, etc). Para conhecer todas as possibilidades do qiime2 vai no 🔗[site](https://docs.qiime2.org/2019.10/) ou digite `qiime --help` na linha de comando.
3) A continuação é necessário colocar o comando a ser rodado dessa ferramenta e finalizar com `\`. A barra invertida significa que você pode escrever na linha de embaixo sem rodar o comando.
4) Posteriormente tem que colocar os parâmetros do comando que você quer usar. Alguns parâmetros são **obrigatórios**. Outros tem valores **default**, ou seja mesmo que você não coloque o parâmetro ele vai ser usado com o valor por *default* da ferramenta. Para saber quais são os parâmetros obrigatórios e os que tem valores default basta com digitar (comando genêrico) `qiime ferramenta comando --help` 🆘
5) Por último um dos parâmetros a colocar é o 📁 de saída, onde serão colocados todos arquivos de saída do comando
Tranquil@ agora mesmo pode parecer confuso, mas na medida que você vai usando os comando do qiime2, você vai conseguir "*pegar o jeito*" 😀

Agora sim o comando para importar os arquivos de sequências dentro do qiime2

## Primeiro crie um diretório para colocar o "artefato" gerado com todas as amostras
mkdir 04.ImportedReads
## Importar como artefato em qiime2
qiime tools import \
  --type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
  --input-path ManifestFile.txt \
  --output-path 04.ImportedReads/reads_trimmed.qza \
  --input-format PairedEndFastqManifestPhred33V2
## Visualização
qiime demux summarize \
 --i-data 04.ImportedReads/reads_trimmed.qza \
 --o-visualization 04.ImportedReads/reads_trimmed.qzv

Use a plataforma qiime2 view para 👀 arquivos `.qzv` [Qiime2 View](https://view.qiime2.org)



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**Uma pausa nos comando para entender uns conceitos muito importantes!!**

Vamos revisar alguns conceitos importantes...
**OTU *(Operational Taxonomic Unit)*:** É uma definição operacional utilizada para classificar grupos de indivíduos próximos. Tipicamente são sequências agrupadas de acordo com sua semelhança uns com os outros (geralmente 97% de similaridade). Se ainda não consegue entender, tente pensar que uma OTU é como uma caixa, pode ter nome (espécie conhecida) ou não (espécie desconhecida) e dentro dela se encontram todos os indivíduos similares (normalmente mínimo 97% de similaridade).
**ASV (*Amplicon Sequence Vatiant*):** É o termo usado para se referir a sequências de DNA individuais. Aqui já não pode pensar que são caixinhas, porque as ASVs não se agrupam por similaridade. Este conceito considera que uma sequência é diferente de outra só com a variação de uma base nucleotídica.

**Mas por qué tem dois conceitos diferentes?** Bom, porque os pesquisadores observaram que nem sempre duas espécies são diferentes porque suas sequências são 3% dissimalares. Tem casos onde tem sequências que são menos de 3% diferentes entre se e são espécies diferentes.

Dito isto, agora vamos a entender a diferença no tipo de clusterização para cada um (ver figura).

 Figura baseada na figura S1 in *Callahan et al. 2016*

A figura mostra uma visão geral do processo de metabarcoding, com os vieses principais que afetam potencialmente a acurácia do sequenciamento. Na amostra **(A)** estão presentes várias espécies com biomassa diferente (indicada pelo tamanho da bolinha) e haplótipos distintos (indicados pela cor). Após a extração de DNA, o gene *barcode* é amplificado usando PCR (B), que pode distorcer a abundância das sequências, e também poderia não amplificas os taxa devido ao viés do iniciador ou à profundidade de sequenciação insuficiente no caso de taxa sub-representada/rara (rosa - sp.5). No processo de high-throughput sequencing (C), muitas novas variantes da sequência falsa são geradas devido a erros de sequenciamento, formação de quimera e mistura de amostras multiplexadas. O impacto desses erros geralmente pode ser reduzido pela rigorosa filtragem de qualidade e pelo agrupamento de seqüências semelhantes em OTU. Normalmente, apenas a sequência mais abundante em uma OTU é considerada e usada para identificar as respectivas espécies (centroides), o que, por sua vez, significa que as informações sobre diversidade genética são perdida. (D) No qiime2 se usam estratégias de ***denoising*** para remover seqüências afetadas por erro de um conjunto de dados e reativar as seqüências de haplótipos reais presentes em uma amostra. O denoising consegue discriminar entre um erro do sequenciamento ou de amplificação na PCR e uma espécie diferente (diferença de no minimo uma base nucleotica). O baseamento é se a sequencia estiver muito representada (abundante) o mais provável é que seja uma sequencia certa, mas se a sequencia estiver em baixa abundância provavelmente é devido a um erro de PCR ou de sequenciamento. Em resumo usando o conceito de OTU, neste exemplo se considerariam só 3 OTUs ou espécies diferentes, enquanto que usando a abordagem de denoising é possivel obter 5 ASVs ou espécies diferentes.

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**Continuemos com os comandos...**

## 5 Denoising, joining reads e remoção de chimeras com DADA2
DADA2 é um programa que é capaz fazer o *denoising*, unir as sequencias (R1+R2) e eliminar as chimeras. Além, com ele você também poderia fazer o controle de qualidade. Se você quiser explorar todas possibilidades que o DADA2 oferece digite `qiime dada2 --help` 🆘 Dependendo do tipo de sequencias que você tenha deve escolher entre `denoise-paired` (sequencias paired-end illumina), `denoised-pyro` (sequencias single-end por pirosequenciamento) e `denoise-single` (sequencia single-end illumina).
No nosso caso, nossas sequencias são paired-end obtidas em plataforma Illumina.
Você também pode ver todos os parâmetros que oferece o comando `denoised-paired`. Digitando `qiime dada2 denoise-paired --help`.

Por enquanto para nosso exemplo e como a gente já fez o controle de qualidade, não vamos usar os parâmetros para trimagem das sequencias.

## Rodar DADA2
qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs 04.ImportedReads/reads_trimmed.qza \
                           --p-trunc-len-f 0 \
                           --p-trunc-len-r 0 \
                           --output-dir 05.Dada2Output

Os arquivos de saída desse comando são
* **denoising_stats.qza**: Este arquivo contém as estatísticas do processo, ou seja, quantas sequencias ficaram depois de unir o R1+R2, remover as chimeras e fazer o *denoising*. Mas ele **NÃO PODE SER ABERTO**, por ser de tipo `.qza`. Tem que ser transformado a `.tsv`.
* **representative_sequences.qza**: Neste arquivo estão cada uma das sequencias representativas encontradas nas amostras. Para aceder as sequencias é preciso transformar a `.fasta`
* **table.qza**: nesta tabela se encontram cada um dos ASVs e as frequências deles.

Para convertir o arquivo de saída das estatisticas do denoising de `.qza` para `.tsv`

qiime tools export --input-path 05.Dada2Output/denoising_stats.qza --output-path 05.Dada2Output
## Ver o arquivo
nano 05.Dada2Output/stats.tsv
## Completar seu arquivo QC_controle.xlsx!!

Para convertir o arquivo de saída das sequencias representativas`.qza` para `.fasta`

qiime tools export --input-path 05.Dada2Output/representative_sequences.qza --output-path 05.Dada2Output/

O arquivo de saída vai ser chamado de `dna-sequences.fasta`

## 6 Asignar taxonomia aos ASVs
**Lembre-se**:exclamation: Não só se limite a cópiar e colar o comando 🙄, tente entender que está acontecendo e quais são as partes do comando 🤓.

Para asignar a taxonomia tem que usar uma base dados **(db)** "treinada" (adaptada para Qiime2). Nos já temos a **db** pronta.
Para 👀 quais **db** temos disponivéis:

ls /home/bioinfo/Documentos/Databases/Fungos

Full ITS - fungi only (`classifier_sh_refs_qiime_ver8_99_s_02.02.2019_ITS.qza`)
Full ITS - all eukaryotes (`classifier_sh_refs_qiime_ver8_99_s_all_02.02.2019_ITS.qza`)
Você vai ver o listado de **db** disponivéis no nosso servidor. Principalmente usamos a **db** Silva que é mais atualizada e acurada. Vai encontrar o *release 132*. **Cuide de escolher bem sua db.**

Agora vamos para o comando de assignação da taxonomia.

## Criar um novo diretório para a classificação taxonômica
mkdir 06.TaxonomyClassification
## Run
qiime feature-classifier classify-sklearn \
  --i-classifier /home/bioinfo/Documentos/Databases/Fungos/classifier_sh_refs_qiime_ver8_99_s_02.02.2019_ITS.qza \
  --i-reads 05.Dada2Output/representative_sequences.qza \
  --o-classification 06.TaxonomyClassification/taxonomyclassification.qza

Se der este `[Errno 28] No space left on device`. A explicação do erro é que qiime2 enquanto vai rodando comandos vai criando arquivos temporais e a :file_folder: onde se estão armazenando está lotado, por tanto vamos a criar uma 🆕 📁 para esses temporais (**ISTO SÓ PRECISA SER FEITO SE SAIR E SÓ SERÁ A PRIMEIRA VEZ QUE VOCE FOR RODAR ESTE COMANDO**). Você pode arrumar com os seguintes comandos e instruções:

## Primeiro precisa desativar o ambiente virtual do qiime2
conda deactivate
## crie uma pasta chamada tmp/ CUIDADO crie ela na sua pasta principal /data/usuário
cd ..
mkdir tmp
## Agora vamos a avisar pro qiime qual é a nova pasta pros arquivos temporais. Lembrando que sempre que está a palavra usuário é para ser substituida como o seu nome de usuário
export TMPDIR=/data/usuário/tmp/
## Conferir
echo $TMPDIR
## Tem que mostrar o caminho para a nova pasta criada.
## Agora roda de novo o comando de asignação da taxonomia. 

Converta o arquivo `taxonomyclassification.qza` para `taxonomyclassification.qzv`

qiime tools export \
   --input-path 06.TaxonomyClassification/taxonomyclassification.qza --output-path 06.TaxonomyClassification

## 7 Avaliação com *BLAST*

O desempenho da classificação taxonômica é difícil de avaliar sem uma referência, no entanto é bom você fazer uma verificação básica comparando as atribuições taxonômicas com os principais acertos do BLASTn para determinados ASVs.

Primeiro é necessário transformar o arquivo `representative_sequences.qza` de saída do **Dada2** e abrir no 🔗[Qiime2 View](https://view.qiime2.org).

qiime feature-table tabulate-seqs --i-data 05.Dada2Output/representative_sequences.qza \
                                  --o-visualization 05.Dada2Output/representative_sequences.qzv

representative_sequences.qzv

Este arquivo facilita fazer o "*blast*" de determinados ASVs no banco de dados NCBI nt. Ao comparar esses hits do BLAST com a atribuição taxonômica dos ASVs (etapa 10), você pode ter certeza de que as atribuições taxonômicas funcionaram corretamente. É uma boa idéia selecionar ~ 5 ASVs para BLAST para essa validação, que deve ser de grupos taxonomicamente diferentes, como diferentes filos, de acordo com o classificador taxonômico.

## 8 Metadata
Crie um arquivo de metadata chamado `sample-metadata.txt`. Nesse arquivo você vai colocar o máximo de informação que permita descrever e diferenciar suas amostras.

## Crie o arquivo com o editor de texto nano
nano sample-metadata.txt
## Coloque quantas colunas (variavéis) você quiser que descrevam suas amostras. Aqui o exemplo para o dataset exemplo do tutorial
sample-id	SampleName	StageOfTreatment	Local	Season	
#q2:types	categorical	categorical	categorical	categorical
amostra1	AFA	AnaerobicFilter	Factory	Autumn
amostra2	STW	SepticTank	School	Winter
amostra3	AFS	AnaerobicFilter	Factory	Summer
amostra4	STS	SepticTank	School	Spring

## A segunda fila é para classificar as variavéis segundo sua natureza (p.e. categorical ou numerical) 

Se deve ver assim:

## 9 Barplot 📊
Você pode construir vários gráficos dentro do qiime2, entre eles 📊. Para dar uma primeira olhada na composição taxonômica de seus dados. No entanto para publicações e trabalhos é melhor construir os gráficos com outras ferramentas como o **software R**.

## Crie um diretório para guardar os gráficos
mkdir 08.Graphs
## Make a barplot
qiime taxa barplot \
  --i-table 05.Dada2Output/table.qza \
  --i-taxonomy 06.TaxonomyClassification/taxonomyclassification.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.txt \
  --o-visualization 08.Graphs/taxa_barplots.qzv

:bar_chart: on Qiime2 View


## 10 Rarefaction curves 📈
Para construir as curvas de rarefação é importante normalizar as amostras todas ao mesmo tamanho, para isto você pode transformar o arquivo `table.qza` para `table.qzv`, e usando o Qiime2 View pode abrir o arquivo e explorar diferentes informações

qiime feature-table summarize \
           --i-table 06.Dada2Output/table.qza \
           --o-visualization 06.Dada2Output/table_summary.qzv \
           --m-sample-metadata-file sample-metadata.txt

table_summary.qzv


Com este arquivo pode ser visualizado o número de ***features*** (ASVs) finais em cada amostra (aba *interactive sample detail*).


Para este caso a amostra com menor número de *features* é amostra2 com 105941. Então vamos a cortar a essa profundidade para as curvas de rarefação. Com este comando você pode construir as curvas de rarefação usando diferentes mêtricas de alfa diversidade, como "obseved_otus", "chao1", "shannon" e "simpson".

## Crie um diretório para armazenar as curvas de rarefação
mkdir 09.RarefactionCurves
## Rodar
qiime diversity alpha-rarefaction --i-table 05.Dada2Output/table.qza \
                                    --p-max-depth 105941 \
                                    --p-steps 10 \
                                    --p-metrics shannon \
                                    --p-metrics observed_otus \
                                    --p-metrics simpson \
                                    --p-metrics chao1 \
                                    --m-metadata-file sample-metadata.txt \
                                    --o-visualization 09.RarefactionCurves/rarefaction_curves.qzv

Como você pode reparar o arquivo de saída já é de tipo `.qzv` (visualização) pra 👀 no Qiime2 View
rarefaction_curves.qzv.

Todas as amostras atingiram o *plateau* por tanto o esforço amostral foi suficiente para acessar a toda a diversidade microbiana das amostras.

## 11 Análise de alfa e beta diversidade
**PARA!** Antes de continuar é **muito importante** você entender que é alfa e beta diversidade, as diferentes mêtricas usadas para a análises e comparações de microbiomas e até testes estatísdicos adequados para este tipo de dados.

Aqui só alguns links e referências recomendados para você revisar antes de continuar 🤓
🔗[Alpha and beta diversity metrics](http://www.evolution.unibas.ch/walser/bacteria_community_analysis/2015-02-10_MBM_tutorial_combined.pdf)
📖 Magurran AE. Measuring biological diversity: John Wiley & Sons, 2013.
:link: [GUide to STatistical Analysis in Microbial Ecology (GUSTA ME)!](https://sites.google.com/site/mb3gustame/home)

**Aqui um resumão do maisss básico** 🤓

**Alfa diversidade** (Dentro das amostras)

***Riqueza de espécies***, quantas espécies ou ASVs diferentes podemos detectar em cada amostra?"
*Mêtricas:* Espécies observadas (observed_otus), ACE, Chao1.

***Diversidade de espécies*** (Shannon index) "How different?"
Como estão distribuidos (equilibrados) estão os microrganismos entre si? Temos uniformidade de espécies (nível de abundância semelhante) ou algumas espécies dominam mais que outras?
*Mêtricas:* Shannon, Simpson.

**Beta diversity** (Entre as amostra)

Quão diferente é a composição microbiana em um ambiente (amostra) em comparação com outro(a)?

A beta diversidade mostra a diferença entre comunidades microbianas de diferentes ambientes (amostras). O foco principal está na diferença nos perfis de abundância taxonômica de diferentes amostras.

***Mêtricas:***

Bray–Curtis dissimilarity
- Baseada na abundância ou *read count*
- Diferenças das abundâncias microbianas entre duas amostras (p.e. A nível de espécie)
Valores desde 0 a 1
0 significa que ambas amostras compartilham a mesma espécie exatamente na mesma abundância.
1 significa que ambas amostras têm espécies e abundâncias totalmente diferentes.

Jaccard distance
- Baseada na presença ou ausência de espécies (Não leva em conta a informação de abundância)
- Diferenças na composição microbiana entre duas amostras
0 significa que ambas amostras compartilham exatamente as mesmas espécies.
1 significa que ambas amostras não tem nenhuma espécie em comum

UniFrac
- Distâncias filogenéticas (árvore filogenética)
- Baseada no comprimento da ramificação compartilhada entre duas amostras ou exclusiva para uma ou outra amostra.
unweighted UniFrac: baseado só em distâncias filogenéticas (Não leva em conta a informação de abundância)
weighted UniFrac: os comprimentos dos ramos são ponderados por abundância relativa (inclui informações filogenéticas e de abundância)

---
***Continuando...***

Nesta etapa vamos a gerar gráficos e tabelas para interpretar a alfa e beta diversidade do *dataset* analisado.

A profundidade deve ser a mesma usada na construção das curvas de rarefação baseada no arquivo `table_summary.qzv`

qiime diversity core-metrics --i-table 05.Dada2Output/table.qza \
                                          --p-sampling-depth 105941 \
                                          --m-metadata-file sample-metadata.txt \
                                          --p-n-jobs 4 \
                                          --output-dir 10.AlphaBetaDiversity

## Para calcular Chao1
qiime diversity alpha --i-table 05.Dada2Output/table.qza \
                        --p-metric chao1 \
                        --o-alpha-diversity 10.AlphaBetaDiversity/chao1_vector.qza
## para calcular Simpson
qiime diversity alpha --i-table 05.Dada2Output/table.qza \
                        --p-metric simpson \
                        --o-alpha-diversity 10.AlphaBetaDiversity/simpson_vector.qza

São varios os arquivos de saída do anterior comando. São de três tipos.
* **Vector**: São os valores de uma mêtrica de alfa diversidade para todas as amostras, organizados em uma tabela. As mêtricas que se organizam em vectores são: observed_otus, shannon, evenness, simpson, chao1, faith_pd.
* **Matrix**: São matrizes de dissimilaridade de diferenter mêtricas, tais como: bray_curtis, jaccard, unweighted_unifrac, weighted_unifrac.

você pode organizar uma tabela com todos os vectores

# Para organizar uma tabela com todos os indices de alfa diverside e estimadores

qiime metadata tabulate --m-input-file sample-metadata.txt \
                          --m-input-file 10.AlphaBetaDiversity/shannon_vector.qza \
                          --m-input-file 10.AlphaBetaDiversity/observed_otus_vector.qza \
                          --m-input-file 10.AlphaBetaDiversity/simpson_vector.qza \
                          --m-input-file 10.AlphaBetaDiversity/chao1_vector.qza \
                          --o-visualization 10.AlphaBetaDiversity/alfadiversidade_all.qzv

Descarrega o arquivo `alfadiversidade_all.qzv` e vai ver ele no Qiime2 View.


## 12 Exportação dos arquivos
Os arquivos finaís que você irá precisar são:
* `table.qza`, o qual irá se convertir em `Otu_table.tsv`. Por default é chamada assim mas no caso do Qiime2 são ASVs. Esta tabela contém as frequencias de cada ASVs em cada amostra
* `taxonomyclassification.qza`, o qual irá se convertir em `Taxonomy_table.tsv`. Esta tabela contém a taxonomia de cada ASV.
* `tree.nwk`
Os dois primeiros devem ser transformados a `.tsv` para ser usados nas análises seguintes.

## Crie um diretório para salvar os arquivos finais 
mkdir 11.ExportFiles
## Primeiro transformar .qza para .biom
qiime tools export --input-path 05.Dada2Output/table.qza \
                     --output-path 11.ExportFiles/
## .biom para .tsv
biom convert -i 11.ExportFiles/feature-table.biom \
               -o 11.ExportFiles/Otu_Table.tsv \
               --to-tsv \
               --table-type "OTU table"

Abra o arquivo gerado `Otu_Table.tsv file` e troque #OTU ID por OTUID.

## Abrir o arquivo
nano 11.ExportFiles/Otu_Table.tsv
## Depois de trocar o #OTU ID por OTUID, sair
[Ctrl + X]
## Deseja salvar as modificações
[s]
## Nome do arquivo (o mesmo)
[Enter]

Agora exporte a tabela de taxonomia

qiime tools export --input-path  06.TaxonomyClassification/taxonomyclassification.qza \
                     --output-path 11.ExportFiles/taxonomy

Abrir o arquivo gerado `taxonomy.tsv`, troque Feature ID por OTUID

nano 11.ExportFiles/taxonomy/taxonomy.tsv
## Depois de trocar o Feature ID por OTUID, sair
[Ctrl + X]
## Deseja salvar as modificações
[s]
## Nome do arquivo (o mesmo)
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Estes arquivos serão usados para nosso tutorial 🗒 de 🔗[análises de microbiomas usando o *software R*.](https://)

# Final `QC_controle.xlsx`

| SampleID | Raw_reads | Post_trim_primers | Perda até aqui| Post_QC_Trim | Perda até aqui | % Perda | Artefato | filtered | Denoised | merged_reads|non-chimeric | Perda até aqui | % perda total |
| -------- | --------- | ------ | ----------------- | --------- | --------- |:---------:| --------- | ---------- | ------ | -------- | ---------- | ------ | ------------ | ---------- | ---------------- | ------------ |
|sample1||||||||||||||
|sample2||||||||||||||
|sample3||||||||||||||
|sample4||||||||||||||

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## FERRAMENTAS ⚒️ IMPORTANTES PARA AS ANÁLISES DOWNSTREAM
🔗 [RAW GRAPHS:](https://rawgraphs.io/) Para construir gráficos, você precisa formatar as tabelas no formato que o site exige.

🔗 [Microbiome Analyst:](https://www.microbiomeanalyst.ca/) É uma ⚒️ *on-line* para análises de microbiomas. Você precisará as saídas do qiime2 -`Otu_Table.tsv`, `taxonomy.tsv`, `sample_metadata.txt`, `tree.nwk` (optional)-.

## Algumas referências
📄 **Qiime2:** Bolyen E, Rideout JR, Dillon MR, Bokulich NA, Abnet C, Al-Ghalith GA, et al. QIIME 2: Reproducible, interactive, scalable, and extensible microbiome data science. PeerJ Preprints, 2018.

📄 **FASTQC:** Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. 2010.

📄 **Trimmomatic:** Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 2014; 30.

📄 **Cutadapt:** Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. journal 2011; 17: 10-12.

📄 **DADA2:** CCallahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: high-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature methods 2016; 13: 581.

📄 **SILVA:** Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, Gerken J, Schweer T, Yarza P, et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic acids research 2012; 41: D590-D596.

📄 **UNITE:** Abarenkov, Kessy, et al. "The UNITE database for molecular identification of fungi–recent updates and future perspectives." New Phytologist 186.2 (2010): 281-285.

**FIM** :sparkle: