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# System prepended metadata

title: Untitled

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## Bioinformática II: Análises de transcriptômica 21\10 e 25/10

diretorio a ser usado: cd /state/partition1
porta: hammer 22

via linux: ssh -p 22 hammer.fcav.unesp.br

df -vh: pra saber quanto está disponivel para vc usar, e quanto está sendo usado.

Profundidade de Cobertura: quantas vezes eu estou mostrando aquela mesma base.

Programas diferentes pode ter resultados diferentes, pois a heuristica de cada um é diferente.

Importante: quantidade de ciclos, e profundidade. Eucariotos: no caso de humanos pelo menos 80 milhoes.

Resolucação de extremidades 3' (Sítios de poli(A)): Conseguimos identificar também a orientação ad ORF.

Importante: sequenciamento strand: fita específica (ss)

Quantificação e qualidade
rRNA 28S e 18S (Razao de 2:1) e procariotos: 23S/16S

- Formato de dados:
- FASTA .fasta, .fa .fna
- FASTAQ .fastq ou .fq
- SRA Sequence read archive: .sra
- SRF Sequence read format: .srf
- SFF Sequence flowgram format .sff
- PHD PHreD: .phd ou .phd.1
- SCF Sequence Chromatogram format: .scf

Pacote emboss: Alteração de formatos

sequence.qual: igual ao fasta mais no lugar das bases, há números separados por espaçõs; Qualidade.

Qualidade: Qphred

```
mkdir ./refs
cd ./refs
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/003/025/095/GCF_003025095.1_Triha_v1.0/GCF_003025095.1_Triha_v1.0_genomic.fna.gz
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/003/025/095/GCF_003025095.1_Triha_v1.0/GCF_003025095.1_Triha_v1.0_genomic.gff.gz
```
Utilize gunzip para descompactar
`gunzip *.gz`

Limpeza dos cabeçalhos FASTA
Criar arquivo com o script (cleanfasta.sh) abaixo:

`nano cleanfasta.sh`
Ctrl+c & Ctrl+v

```
#!/bin/bash

infile=$1
if [ ! ${infile} ]; then
        echo "Missing input fasta file"
        exit
fi
if [ ! -e ${infile} ]; then
        echo "Not found input fasta file (${infile})"
        exit
fi


sed 's/^>\(\S\+\).*/>\1/' ${infile}
```
Dar permissão:

`chmod a+x cleanfasta.sh`
Executar:

`./cleanfasta.sh GCF_003025095.1_Triha_v1.0_genomic.fna > genome.fa`
Ajuste do arquivo GFF:
Executar o script fixNCBIgff.sh:

`fixNCBIgff.sh GCF_003025095.1_Triha_v1.0_genomic.gff genome.gff`

Script:

```
#!/bin/bash

infile=$1
outfile=$2

if [ ! ${infile} ]; then
	echo "Missing input file"
	exit
else
	if [ ! -e ${infile} ]; then
		echo "Wrong input file (${infile})"
		exit
	fi
fi

infbn=`basename ${infile} .gff`;

if [ ! ${outfile} ]; then
	outfile="${infbn}_fixed.gff"
fi
```

```
grep -v -P '\t(cDNA_match|match|repeat_region|region|D_loop|sequence_feature|binding_site|mobile_genetic_element|origin_of_replication|STS|sequence_alteration|Shine_Dalgarno_sequence|ribosome_entry_site|recombination_feature|stem_loop|RNase_P_RNA|telomere|centromere|telomerase_RNA|RNase_MRP_RNA|riboswitch|minus_35_signal|minus_10_signal|protein_binding_site)\t' ${infile} | 
grep -v -P '^(##sequence-region|##species|#!genome-build|!processor|#!gff-spec-version)' | \
fixGFFgenestruct.pl | \
fixGFFdupID.pl | \
sortGFF.pl > ${outfile}
```

Importante: gffread - extrai o transcriptoma ou proteoma

gffread -h consulto o help 

-g (arquivo da seq fasta)
gff read (nome do arquivo gff)

gffread genome.gff -g genoma.fa -w

-w: gerar a seq, reunir todos os exons por transcrito

se quero a tradução: com o -x eu pego o cds.

gffread genome.gff -g genoma.fa -x

se quero a seq de proteina -y

gffread genome.gff -g genoma.fa -y proteina.fa

Testes com GFF
Para a conversão de GFF versão 3 para um arquivo GTF:
`gffread genome.gff -g genome.fa -T -o genome.gtf`
Para obtenção de um arquivo com a sequência FASTA do trasncriptoma:
`gffread genome.gff -g genome.fa -w transcriptome.fa`
Para obtenção de um arquivo com a sequência FASTA do proteoma:
`gffread genome.gff -g genome.fa -y proteome.fa`

para indexar o genoma:
`bowtie2-build -f genome.fa genome_index`

```
bowtie2 --help
```



Returning from initFromVector
Wrote 44026413 bytes to primary EBWT file: genome_index.rev.1.bt2
Wrote 29870612 bytes to secondary EBWT file: genome_index.rev.2.bt2
Re-opening _in1 and _in2 as input streams
Returning from Ebwt constructor
Headers:
    len: 119482427
    bwtLen: 119482428
    sz: 29870607
    bwtSz: 29870607
    lineRate: 6
    offRate: 4
    offMask: 0xfffffff0
    ftabChars: 10
    eftabLen: 20
    eftabSz: 80
    ftabLen: 1048577
    ftabSz: 4194308
    offsLen: 7467652
    offsSz: 29870608
    lineSz: 64
    sideSz: 64
    sideBwtSz: 48
    sideBwtLen: 192
    numSides: 622305
    numLines: 622305
    ebwtTotLen: 39827520
    ebwtTotSz: 39827520
    color: 0
    reverse: 1
    
    
```
bowtie2 -x Ref/genome_index -c "GGTTTTCTTTCCTTCACTTAGCTATGGATGGTTTATCTTCATTTGTTATATTGGATACAAGCTTTGCTACGATCTACATT
TGGGAATGTGAGTCTCTTATTGTAACCTTAGGGTTGGTTTATCTCAAGAATCTTATTAATTGTTTGGACTGTTTATGTTT
GGACATTTATTGTCATTCTTACTCCTTTGTG" > bowtie2-test.txt> bowtie2-test-statistics.txt
```

ou
```
bowtie2 -x Ref/genome_index -c "GGTTTTCTTTCCTTCACTTAGCTATGGATGGTTTATCTTCATTTGTTATATTGGATACAAGCTTTGCTACGATCTACATT
TGGGAATGTGAGTCTCTTATTGTAACCTTAGGGTTGGTTTATCTCAAGAATCTTATTAATTGTTTGGACTGTTTATGTTT
GGACATTTATTGTCATTCTTACTCCTTTGTG" -S bowtie2-test.txt
```
 indexação: contruir um indice para facilitar buscas no genoma.
 
 bowtie2-inspects : recupera a seq fasta a partir do indice, caso vc perca por algum motivo a seq fasta original.
 
 Bowtie: 
 - end to end: não eh global, somente as extremidades das reads devem ser alinhadas, e nao ambas(reads e ref)

- local: as extremidades das reads podem não alinhar com a referencia.

time antes do comanda mostra o tempo de execução.

quanto menor o tamanho da seed maior a sensibilidade, pois mais regioes vc encontra no genoma.

-N = numero de mismatches que aceita
L= comprimento da seed

`bowtie2 -N 1 -L 12 -i S,1,0.25 -D 30 -R 5 -x ./genome_index -1 /home/jcardoso/sim/raw/SAMPLEA1_R1.fastq -2 /home/jcardoso/sim/raw/SAMPLEA1_R2.fastq -S bowtie2-algA1.txt`

`time bowtie2 -x /state/partition1/jcardoso/Ref/genome -q -1 /home/jcardoso/sim/raw/SAMPLEA1_R1.fastq -2 /home/jacardoso/sim/raw/SAMPLEA1_R2.fastq -S bowtie2-algA1.sam`

25001 reads; of these:
  25001 (100.00%) were paired; of these:
    12301 (49.20%) aligned concordantly 0 times
    12700 (50.80%) aligned concordantly exactly 1 time
    0 (0.00%) aligned concordantly >1 times
    ----
    12301 pairs aligned concordantly 0 times; of these:
      2127 (17.29%) aligned discordantly 1 time
    ----
    10174 pairs aligned 0 times concordantly or discordantly; of these:
      20348 mates make up the pairs; of these:
        12318 (60.54%) aligned 0 times
        8030 (39.46%) aligned exactly 1 time
        0 (0.00%) aligned >1 times
75.36% overall alignment rate

real    0m13.745s
user    0m11.800s
sys     0m1.182s

```
samtools view -b bowtie2-algA1.sam > bowtie2-algA1.bam

samtools sort bowtie2-algA1.bam -o bowtie2-algA1-sorted.bam
```
`samtools index bowtie2-algA1-sorted.bam`

MAPQ = Score de alinhamento = quanto maior melhor.
Importante: checar qual o metodo para calcular p, pois algumas são fixos.

Tophat>>> Star
Tophat> detecção abinitio de sitios de splicing:nao precisa passar nenhuma coordenada de sitios de junção, ele é responsável pela identificação desses sitios.

```
STAR	--runThreadN        7 \
        --runMode           genomeGenerate \
        --genomeFastaFiles  ./genome.fa \
        --genomeDir         ./star_index \
        --sjdbGTFfile       ./genome.gtf \
        --sjdbOverhang      149
```


    STAR	--runThreadN	     7 \
	        --genomeDir	     ./state/partition1/jcardoso/Ref/star_index \
	        --readFilesIn	     ./home/jcardoso/sim/raw/SAMPLEA1_R1.fastq \
			             ./home/jcardoso/sim/raw/SAMPLEA1_R2.fastq \
	        --sjdbGTFfile	     ./state/partition1/jcardoso/Ref/genome.gtf \
        	--outFileNamePrefix ./state/partition1/jcardoso/Ref/star_out/align
            
            
            
     STAR  --runThreadN     7          --genomeDir     ./state/partition1/jcardoso/Ref/star_index         --readFilesIn     ./home/jcardoso/sim/raw/SAMPLEA1_R1.fastq              ./home/jcardoso/sim/raw/SAMPLEA1_R2.fastq         --sjdbGTFfile     ./state/partition1/jcardoso/Ref/genome.gtf     --outFileNamePrefix ./state/partition1/jcardoso/Ref/star_out/align



